杂交后的漂洗.PDFVIP

1、加入探针，加灭菌水使总体积达到60mL。使用终浓度为5×105dpm/mL的标记探针； 2、加入0.1ml/cm2的杂交液到膜里。然后轻微振荡，65℃温浴过夜（如果杂交在瓶中进 行，保证杂交液体积足够使膜湿润，一般来说10-15mL/瓶）。 另一个经常使用的杂交流程，具体如下： 1、膜通过放置在含杂交液的塑料袋中进行预杂交（2-4mL/100cm2膜），DNA转移时在 65℃温浴30分钟，RNA转移时在42℃温浴30分钟； 2、煮沸5分钟变性标记的探针，之后骤冷1分钟； 3、加入足够的变性的标记探针得到每100cm2膜2ml的杂交溶液，最后探针的浓度达到 1-10pg/mL； 4、把膜从预杂交袋中取出置于新的杂交袋中，杂交溶液中含有变性的探针(在瓶中杂 交也可以使用Church 缓冲液：7%(体积：体积) SDS，250mM磷酸盐溶液pH7.4)； 5、65℃(DNA) 或者42℃ (RNA) 温浴4小时或过夜。 杂交后的漂洗 把膜放入新的袋子或者容器中，然后用2mL/cm2的溶液洗膜 1、室温下用2×SSC，0.1% SDS洗15分钟； 2、室温下用1×SSC，0.1% SDS洗15分钟； 3、65℃用0.1×SSC，0.1% SDS洗20分钟 (使用前预热溶液)； 4、用杂交膜轻轻地沾杂交纸以除去多余的液体，不要让膜完全干透。 该漂洗主要用于初次使用。不同的探针可能需要对漂洗时间、次数等进行优化。 注意：漂洗过度可能降低灵敏度。 如果膜需要用来再次杂交，不要让膜在任何时候干透。膜在短期内 (1个月) 可以夹 在层析纸中保存于4℃。 放射自显影 1、把湿的膜包在干净的塑料膜中； 2、在暗房中，把膜装入放射自显影片夹中，让膜与凝胶接触的那一面与X光片或者自 显影胶片(如：柯达XAR)相对，让片夹保存在-80℃中，一般曝光时间是24-48小时。 重新杂交 Biodyne系列膜可以容易地再次杂交。用于32P标记的探针的流程如下（此方法遵从F.B.I 建议，同样可以应用于非放射性的技术）：在一些预杂交、杂交或封闭等包含蛋白 质体系的步骤中，可能需要用蛋白酶(0.5mg/mL蛋白酶K，0.1%SDS，65℃60分钟)预处 理，让洗脱试剂能够接触到杂交的DNA。 甲酰胺洗脱（DNA转移） 甲酰胺是一种危险的化学试剂，其健康威胁包括对接触的皮肤、眼睛或黏膜的刺激， 可造成肝损伤??摄入会导致头痛、头晕和呕吐。甲酰胺应储存于阴冷、干燥和远离火 源的区域，并且只能在通风橱里操作，并使用防化学的手套和安全的吸取设备。在操 作前请仔细阅读生产商的物质安全资料(MSDS，Material Safety Data Sheet)。 这个流程被F.B.I建议用来使用32P标记的探针杂交转移的DNA 1、在下面的溶液(20ml每cm2膜)中65℃温浴杂交膜60分钟： - 9 -