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总RNA的分离纯化和逆转录实验
人外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录;外周血单个核细胞分离原理;实验步骤;4. 吸取出最上层血浆（弃用），再吸取单核细胞层至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm,5min；
5.去上清（弃用），加生理盐水0.5ml 吹打混匀后，转入1.5mlEP管中，2500rpm,5min；
6.去上清（弃用），留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。
;RNA提取原理; 酸性酚法抽提RNA
其原理是，苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。
;抑制RNA酶活性的试剂
1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。
2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失 抑制外源性RNA酶活性。
;单??细胞中总RNA的提取
1.在上述Ep管中加入500μl变性液（TRIzol:苯酚+异硫氰酸胍）、悬浮细胞，加100 μl氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴5min.
2.4℃,12000rpm,离心20min。吸取上层无色水相转入另一1.5mlEP 管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。
3. 4℃ 12000rpm,离心20min,去上清，加入500 μl 70%乙醇（不吹打） 4℃ 12000rpm,离心15min，去上清，烘干。
4.加10 μl DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。;注意事项;; 完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶、适当的反应缓冲液。RNA模板、逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。
本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。
;逆转录
反应体系：
MgSO4 2 ml
2*bcastBuffer 5 ml
dNTP 0.5 ml
RNasin 0.25 ml
Random primer 0.5 ml
样品总RNA 1.25 ml
总体积 10 ml
;反应体系：
10*Buffer 2 ml
Mg2+ 1.5 ml
dNTP 2 ml
cDNA 5 ml
Taq 0.2 ml
primer 2 ml
ddH2O 17.3 ml
总体积 30 ml
;结果与分析
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