测序标准操作流程.PDF

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2017-04-28 发布于天津
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测序标准操作流程 Field Application Scientist Tel :800 820 8982/400 820 8982 E-mail: cntechsupport@ The world leader in serving science1 推荐的反应体系 — 96孔板( 20?l ) DNA 1 ?L 引物 (3.2 pmol/?L) 1 ?L BigDye(2.5x) 8 ?L 去离子水 10?L 总体积 20?L BigDye的终浓度：(2.5x × 8 ?L) / 20 ?L = 1x 2 推荐的反应体系 — 384孔板( 10?l ) DNA 1 ?L 引物 (3.2 pmol/?L) 1 ?L BigDye(2.5x) 4 ?L 去离子水 4 ?L 总体积 10 ?L BigDye的终浓度：(2.5x × 4 ?L) / 10 ?L = 1x 3 1/2反应体系 — 96孔板（20?l） DNA 1 ?L 引物 (3.2 pmol/?L) 1 ?L BigDye(2.5x) 4 ?L Seq Buffer（5x） 2 ?L 去离子水 12 ?L 总体积 20 ?L BigDye的终浓度：(2.5x × 4 ?L + 5x × 2 ?L ) / 20 ?L = 1x 4 BigDye的稀释 ? BigDye原液是 2.5x；Sequencing Buffer是5x ? 在任何反应体系中，BigDye缓冲液的终浓度应保持1x ? 如果BigDye用得太少，浓度 1x，则需添加Sequencing Buffer使缓冲液终浓度达到1x ? 在PCR循环过程中不要有蒸发，以免影响缓冲液终浓度 ? 高质量的管子和管盖能防止蒸发，较大反应体积可减小蒸发的影响 5 测序PCR循环条件 ? 一般测序： 96 ?C 1 min ? (96 ?C 10 sec ? 50 ?C 5 sec ? 60 ?C 4 min) x 25循环? 4 ?C保温 ? 大分子测序： 95 ?C 5 min ? (96 ?C 30 sec ? 5