shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF7-AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究的论文.docVIP

　　shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF7/AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究的论文 摘要】 目的：探讨靶向增强型绿色荧光蛋白（egfp）小发夹结构rna(short hairpin rna，shrna)对耐阿霉素的人乳腺癌细胞(mcf7/adrr)中egfp基因表达的抑制作用。方法：构建针对egfp基因的shrna表达载体，与pcdna3.0 egfp质粒共转染mcf7/adrr细胞，分别用激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope, lcsm)和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染psilencertm 3.1h1 neo egfp shrna质粒和pcdna3.0 egfp质粒后，荧光显微镜观察结果显示mcf7/adrr细胞中发出荧光的细胞数量减少，荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至35.6%，差异有显著性。结论：靶向egfp 的shrna表达质粒能有效而特异抑制egfp在mcf7/adrr中的表达，mcf7/adrr细胞中存在rna干扰现象，为进一步利用rna干扰技术逆转乳腺癌多药耐药性的研究奠定基础。 【关键词】 rnai 绿色荧光蛋白 乳腺肿瘤 shrna表达载体 　　inhibition of green fluorescent protein expression by short hairpin rna expression vector in human breast cancer cells（mcf7/adrr） 　　gan huizhu, zhang guizhen, zhang fengchun, bu lisha, yang shaojuan, gao shen, zheng deming. 　　department of hematology, chinajapan union hospital, jilin university, changchun 130031, china 　　［abstract］ objective:to investigate ultidrug resistance human breast cancer cells(mcf7/adrr).methods:the shrna expression vector targeting egfp gene cf7 cells and mcf7/adrr cells icroscope and floetry.results:in mcf7/adrr cells transient cotransfected 3.1h1 neo shrna and pcdna3.0 egfp expression vectors,lcsm sho assay shocf7/adrr cells effectively and specifically, rna interference exists in mcf7/adrr cell line, ultidrug resistance by rnai in breast cancer cells. 　　［key ；shrna expression vector 　　rna干扰（rna interference，rnai）是近年来兴起的分子生物学技术，是在研究反义rna作用过程中发现的，首先在华丽新小杆线虫（c.elegans）中证实［1］；是由dsrna（doublestranded rna）介导的基因阻抑现象，由于这是一种在rna水平的基因表达抑制，故称为rna干扰，简称rnai。.rnai技术的发展已经成为人类研究基因功能、抗病毒、治疗恶性肿瘤的一种新方法［26］。绿色荧光蛋白（gfp）可作为报告基因、定位标志，并可用于基因转染效率的测定［7］。增强型绿色荧光蛋白（egfp）是绿色荧光蛋白的突变型，所发荧光强度高，通过显微镜可直接观测、快速、简便。本研究构建了针对egfp基因的shrna表达载体，观察其在耐阿霉素的人乳腺癌细胞中对egfp表达的抑制作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 质粒和细胞株 pcdna3.0 egfp质粒由中日联谊医院基本外科曹宏惠赠；psilencertm 3.1h1 neo sirna表达载体购自美国ambion公司。敏感的和耐阿霉素的人乳腺癌细胞株mcf7/s、mcf7/adrr由上海第二医科大学附属仁济医院张凤春教授惠赠。 　　1.2 试剂 t4dna连接酶购自美国promega公司；bamh ⅰ和hind ⅲ内切酶购于日本takara公司；质粒抽提试剂盒dna purification system i