人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达的论文.docVIP

　　人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达的论文 作者：夏桂枝，张国成，陈新民，洪新如 【摘要】 　　目的： 构建人epo基因真核表达载体并转染人脐血间充质干细胞，获得稳定表达人epo的人脐血间充质干细胞. 方法 ： 从人胎肝细胞中提取总rna，经过rtpcr方法扩增人epo全长cdna， 应用 基因重组技术将epo cdna基因亚克隆至pcdna3真核表达载体内，以酶切和测序方法鉴定重组质粒pcdna3-epo构建的正确性，再将pcdna3-epo经脂质体介导转染人脐血间充质干细胞，经g418筛选后获得稳定转染epo基因的人脐血间充质干细胞，用rt-pcr，: to construct the eukaryotic expression vector of human epo gene and explore its expression in mesenchymal stem cells (mscs) derived from human umbilical cord blood (ucb). methods: the total rna human fetal liver cells. epo cdna plication and subcloned into pcdna3 vector to construct rebinant pcdna3-epo plasmid. after identified by restriction enzyme analysis and sequencing,the pcdna3-epo an ucb-derived mscs mediated by lipofectamine and the expression of exogenous epo ined by rt-pcr,munocytochemistry. results: the rebinant pcdna3-epo eet the design by restriction enzyme analysis and sequencing. the results of rt-pcr,munocytochemical analyses indicated that the exogenous epo successfully expressed in human ucb-derived mscs. conclusion: the rebinant pcdna3-epo an epo cdna is successfully constructed and human ucb-derived mscs esenchymal stem cells; transfection 　　0 引言 　　近年 研究 发现促红细胞生成素（erythropoietin，epo）具有神经营养、神经保护和促进神经发育的作用，在脑组织损伤尤其是新生儿缺氧缺血性脑损伤中发挥着重要作用［1］. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs）是近年发现的一种具有多向分化潜能的成体干细胞［2］，而且是外源基因良好的细胞载体［3-4］. 我们构建人epo基因真核表达载体，将其转染人脐血mscs，观察epo在人脐血mscs中的表达情况，以探索epo基因修饰的人脐血mscs用于移植 治疗 新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，hie）的可行性. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 人胎肝细胞系l02，质粒pcdna3由福州总 医院 实验科王水良博士惠赠. 菌种e. coli dh5α为福州总医院实验科保存. rt-pcr反转录试剂盒（promega公司）；dna胶回收试剂盒（上海华尧核酸技术有限公司）；质粒抽提纯化试剂盒（qiagen公司）；ecorⅰ，xhoⅰ限制性内切酶，dntp，taq酶，t4 dna连接酶，dna分子质量marker dl2000，dl15000（takara公司）；lipofectamim 2000，trizol（invitrogen公司）；mscs培养基mesenculttm（stem cell公司）；兔抗人epo抗体、hrp-羊抗兔igg， plus试剂盒（北京中杉生物技术公司）. 　　1.2 方法 　　1.2.1 epo cdna的合成 参照trizol说明书抽提人胎肝l02细胞总rna，反转录为人胎肝细胞总cdna，以反转录产物为模板，pcr法扩增epo cdna. pcr引物根据genbank中登录的epo cdna 全长序列设计两对引物. 扩增epo cdna全长序列上游引物： 5′-atgaat