第4章克隆载体的特征及类型.pptVIP

第四章 基因克隆的载体;;第一节 载体的功能及特征;载体应具备的条件;自主复制型载体和附加载体的扩增方式 ;载体的类型;克隆载体(cloning vector) ;穿梭载体(shuttle vector) ;第二节 质粒;天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环(ocDNA)和线性(lDNA)构型。? ;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;质粒;由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。;质粒; 利用抗性基因进行重组子的筛选;质粒基因编码的特性;天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-30/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell，标记基因为Tcr;理想的质粒载体应具备的条件;　　天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件　　 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。;质粒;质粒;优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。;;质粒;pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。;质粒;质粒;在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。;质粒载体总体评价;第二??? 噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;l 噬菌体生物学特性： 生物结构;噬菌体或病毒DNA;;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;噬菌体或病毒DNA;第三节 考斯质粒;将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。 ;考斯质粒（cosmid）;考斯质粒（cosmid）;人造染色体载体;人造染色体载体;人造染色体载体;人造染色体载体