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首先了解样品的性质一般性质：试样的体积、酶（蛋白质）和杂质的量、试样的pH及离子强度酶的物化特性：大小、pI、S(solubility)、亲水性、化学性质酶的生化特性：稳定性、辅助因子;考虑相容性A.开始阶段样品体积、数量大 首先考虑高容量capacity，其次高分辨率resolution处理量小时则反之B.盐析后盐浓度高，影响离子交换色谱和电泳，需先进行透析或凝胶过滤脱盐。;C 分离的每个步骤选择不同性质的分离方法 D 最后分离条件注重复原性、快速，因为蛋白质越纯稳定性下降越快。;2.初步纯化一般注意点：A. 温度B.避免极端I,pHC.有机溶剂D.蛋白质的浓度（高 稳定，因为蛋白质带负电，排斥力大）E.避免泡沫和膜的形成F.酶的活性;6.纯化步骤的定量评价;7.在纯化过程中酶活力的损失主要原因：蛋白质变性 避免方法：改变温度和pH 其他原因：辅助因子被去除;酶分离纯化的方案设计;a. Sketch the elution profile expected if this mixture is run on a Sephadex G-100 gel filtration column run in 50 mM phosphate buffer, pH 6. Label the peaks. b. Sketch the gel obtained from running these proteins on an SDS polyacrylamide electrophoresis gel at pH 8.0, (after staining and destaining). c. What predictions can you make about the results of a native PAGE at pH 7.6 ( state any assumptions you might need to make about the % acrylamide in the gel ) ;d. Sketch the elution profile of these proteins from a carboxymethyl cellulose ion exchange chromatography column, run at pH 6.25 (with a salt gradient, if necessary). Label the peaks. ;第七节 蛋白质浓度的测定 ;Determination of enzyme activity;Enzyme activity;Active unit （U）;实例;;果胶酶活力的测定;;蛋白酶活力的测定;国标 (QB547-80) 原理：蛋白酶水解酪蛋白，其产物中含酚基的氨基酸在碱性条件下能被福林 (Folin) 试剂还原，生成蓝色化合物，从蓝色的深浅测知酶活力的大小。;底物：0.5%酪蛋白 缓冲溶液：0.02M，pH7.5PB 酶液配制：精确取定量的酶粉100mg，加少量缓冲液研磨，定容100ml，离心，取上清液10ml定容100ml。 酶活力测定：酶和底物分别于30℃水浴???温，取出2ml底物加入稀释的酶液1ml，立即混匀计时，反应15min，立即加入3ml 10%TCA终止，室温静置半小时，过滤，取1ml滤液用Folin-phenol法测定可溶性蛋白质，680nm比色。; 酶活力定义：在30℃pH7.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1?g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。目前国内工厂都以1g酶制剂所含的酶活力单位数来表示酶制剂的活力。 酶活力单位=6/15?K?O.D?n;脂酶活力的测定 ;3. 反应中产生的H+与加入的NaHCO3作用释出 CO2，后者可用呼吸仪测定； 4.测定脂肪酸的产生而导致的反应体系表面张力的下降； 5.采用生色底物，如乙酸?-萘酯;过氧化物酶活力的测定;多酚氧化酶活力的测定;脂肪氧合酶的活力测定;Specific activity;分离方法;分离方法;■ 蔗糖合成酶的纯化表：;■ 蔗糖合成酶的纯化表：;Complete the following on purification table