组织对氧磷酶1(PON1)有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒.docVIP

PAGE  PAGE 4 组织对氧磷酶1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书 （中文版） 主要用途 组织对氧磷酶1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过对氧磷酶1反应系统中，水解有机磷酸，释放出对硝基苯产物，出现吸光峰值的变化，即采用光度法来测定组织样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体组织裂解悬液样品对氧磷酶1的有机磷酸酶活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3.1.8.1）是一种水解酯类（esters）、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的多态性酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（high density lipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清（50毫克/升）中。具有有机磷酸酶（organophosphtase）、磷酸三酯酶（phosphotriesterase）、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolactonase）等多重活性：PON1与HDL结合，水解各种LDL和HDL上的氧化性磷酯，以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等，例如杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon）、毒死蜱（chlorpyriphos）、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman）、同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC）、γ-丁内酯（γ-butyrolactone）等，延缓和抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein；LDL）氧化作用，阻止脂质过氧化物产生，保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤，达到抗粥样硬化（antiatherogenic）、解毒、抗氧化的功能。PON1活性降低与慢性肾衰、糖尿病、外周神经病变、家属性高胆固醇血症、心血管疾病、肝纤维化等有关。PON2为44Kd分子量，分布在脑、肝脏、肺、肾脏、睾丸等大多数组织中，但血清中测不到。PON2具有水解芳香酯和内酯酶的功能，但不能水解有机磷酸。具有细胞内抗氧化作用，预防粥样硬化等功能。PON3为40Kd分子量，主要分布在肝脏中，少量在肾脏中。主要水解各种内酯和环状羧酸酯，具有抗氧化功能。基于人工合成底物对硝基苯磷酸二乙酯（diethyl-p-nitrophenylphosphate），在对氧磷酶1的作用下，水解产生对硝基苯（p-nitrophenol）和磷酸二乙酯（diethyl phosphate），通过对硝基苯产物吸收峰值的变化（405nm波长），来定量分析对氧磷酶1的有机磷酸酶活性。其反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A） 毫升 裂解液（Reagent B） 毫升 缓冲液（Reagent C） 毫升 底物液（Reagent D） 毫升 阴性液（Reagent E） 毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品CAOZUO1的容器 15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器 （微型）台式离心机：用于样品制备 比色皿或96孔板：用于光度测定的容器 分光光度仪或酶标仪：用于光度分析 实验步骤 样品准备 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管 （选择步骤）加入xx毫升 清理液（Reagent A）清洗1次 移入到一个液氮冻存管 即刻放进液氮罐过夜 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融） 放进一个15毫升锥形离心管 加入预冷的xx微升 裂解液（Reagent B） 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡30秒，充分混匀 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用） 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bra