红花中黄酮类化合物抑制基质金属蛋白酶活性实验研究.docVIP

长春师范大学本科毕业论文（设计） PAGE  PAGE 12 第一章 前 言 1.1 红花简介 红花( Carthamus tinctorius L．)为菊科植物，红花属红花的干燥花，生长周期为1~2年，在国际上，印度、美国、埃塞俄比亚、澳大利亚等地为红花主要种植地，在我国则主产于河南、云南、浙江等地，由于其在种植方面有较好的抗旱、耐盐碱、抗寒、用途广泛等诸多优点，在我国栽培种植已经有两千多年的历史[1-3] 在历史上，红花被赋予了多种意义，不仅可以用来药用，还可用于食用、染料和油料等。虽然红花成分较为复杂，但已被分离鉴定的化学成分有60多种，主要分为黄酮类、木脂素类、多炔类等几大类，而且存在着200多种色素类成分，其中含有丰富的黄色素和红色素，这是一种纯天然染色剂。其他类型的黄酮类物质，主要有山奈酚（Kaempferol）和槲皮素（Quercertin）为基本母核的一系列衍生物及芦丁（Rutin），杨梅素（Myricetin），芹黄素（Apigenin），木樨草素（Luteoline）等。研究表明红花有效成分主要为红花黄色素，是一组水溶性查尔酮类成分，红花中查尔酮类化合物多为色素类成分，而其中最重要的就是红花黄色素（safflower yellow，SY）。SY由红花黄色素A（HSYA）和红花黄色素B(SY-B)及其衍生物组成，羟基红花黄色素（Hydroxyl safflower yellow A，HSYA）的研究是最为广泛的，日本学者龟高德平首先从我国河南承德红花干花中分得红色素（含0.3%～0.6%），它是红花中含量最高的成分[4-7]。红花黄色素有改善心肌及脑组织微循环障碍的作用[8]，亦有扩张冠脉，抗氧化，保护心肌，降血压，免疫抑制和脑保护的多种药理学功效[9]。 1.2基质金属蛋白酶（MMPs）简介 ECM（extracellular matrixc）是一种存在于细胞间隙中的大分子物质，其临床方面对于研究肿瘤转移有着极其重要的意义，应用蛋白酶降解ECM是治疗多种疾病的有效方法，如强直性脊柱炎，心脑血管疾病，肿瘤，糖尿病，炎症等[10-12]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类与Ca2+，Zn2+金属离子结合，可对ECM有极强降解作用的超酶家族，据现阶段研究表明MMPs已鉴定出28种，其又可以分为5大类，分别为①胶原酶、②明胶酶、③基质裂解酶、④膜型金属蛋白酶、⑤其它型。这里，胶原酶主要包含MMP-1、MMP-8、MMP-13，明胶酶主要包含MMP-2、MMP-9，基质裂解酶主要包含MMP-3、MMP-10、MMP-11，膜型金属蛋白酶主要包含MMP-14，MMP-15，MMP-16、MMP-17、MMP-24、和MMP-25。酶本身的活性点各不相同，这种不同主要是由于染色体序列不同所导致，由此各蛋白酶对应的底物与抑制剂也各有不同。根据报道，MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响，而MMP-2的活性也与癌栓及肿瘤大小密切相关[ 13~ 15]。本实验研究红花体外抑制基质金属蛋白酶- 2活性的作用及抗肿瘤机理，从而为从分子水平上研究红花的治病机理奠定基础，也为进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。第二章 实验部分 2.1 实验材料、试剂 红花药材购买于北京同仁堂大药房（长春汽车厂分店）。羟基红花黄色素A（Hydroxyl safflower yellow A，HSYA）标准物质购于中国药品检验所（北京）、红花黄色素B（Anhydrosafflor yellow B，SY-B）标准品为实验室自主分离（纯度达98%）。HEPES（Promega），基质金属蛋白酶-2（MMP-2，Sino-Bilogical），GM-6001（ENZQ），0.05% Brij-35（SANTA），荧光底物DQ（TM）GELTIN FROM PIG（Life），无菌水，DMSO等。 2.2 仪器设备 96孔酶标板（鼎国），Thermo Scientific Varioskan Flash 全波长扫描式多功能读数仪（Beckman），恒温培养箱（德国）。 2.3 样品制备 自制HEPES缓冲溶液（pH 7.0），其成分为50 mM HEPES、0.2 M NaCl、10 mM CaCl2、20 μM ZnSO4及0.05% Brij-35。精密称取适量广谱MMP的抑制药物GM-6001，用DMSO溶解，配置成15 nmol/L GM-6001溶液待用，于-20℃下保存。精密称取适量荧光底物DQ-gelatin，用HEPES缓冲溶液溶解，配置成每50?L缓冲溶液中含有0.2 ?g的DQ-gelatin溶液待用，于-20℃下保存。 称取100