姜黄素对喉癌Hep2细胞的诱导凋亡作用及细胞周期的影响的论文.docVIP

　　姜黄素对喉癌Hep2细胞的诱导凋亡作用及细胞周期的影响的论文 姜黄素对喉癌hep2细胞的诱导凋亡作用及细胞周期的影响 【关键词】 姜黄素;喉癌细胞;ao染色法;凋亡;细胞周期 【摘要】 目的 探讨姜黄素对人喉癌hep2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞形态及细胞周期各时相的影响。方法 hep2细胞暴露于含姜黄素(0～25 μmol/l)的培养基中，分别培养24 h及48 h，用吖啶橙染色法(ao染色法)检测对细胞形态的影响;用流式细胞术检测对细胞周期各时相及凋亡率的影响。结果 ao染色法显示，姜黄素可诱导hep2细胞形态发生明显变化，呈时间剂量依赖性;fcm结果显示，姜黄素可使hep2细胞s期细胞数明显减少，并诱导细胞出现典型的凋亡峰，凋亡率呈时间剂量依赖性。结论 姜黄素可诱导喉癌hep2细胞呈典型的凋亡形态，诱发凋亡峰，使hep2细胞阻滞在g2/m期。 【关键词】 姜黄素;喉癌细胞;ao染色法;凋亡;细胞周期 　姜黄素作为一种植物多酚，主要来源于姜科姜黄属植物，姜黄是其主要活性成分，具有抗感染、 抗炎、 抗凝、 抗氧化、 清除自由基等作用〔1～3〕。近年有研究表明，姜黄素还具有抗肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、大肠癌、胰腺癌和乳腺癌等〔4～8〕作用。喉癌是头颈外科一种比较常见的恶性肿瘤，近年来的发病率有上升的趋势;虽然对于喉癌的临床治疗手段不断改进，但其治疗效果仍不尽人意，尤其是晚期喉癌，所以有待于开发研究出更行之有效的抗喉癌的药物。.目前国内外关于姜黄素对喉癌的抑制作用及其作用机制的研究报道甚少。本研究探讨了不同浓度姜黄素是否对人喉癌(hep2)细胞具有诱导凋亡作用，及其对细胞形态、细胞周期进程及凋亡率的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞与试剂 　　人喉癌hep2细胞购于上海细胞生物研究所。 rpmi1640培养基购于gibco/brl公司。姜黄素(curcumin)购自美国sigma公司，用二甲基亚砜(dmso)溶解后配成50 mmol/l的贮存液置于-20℃冰箱保存，实验时稀释至所需浓度。吖啶橙(ao)及碘化丙啶(pi)购于北京鼎国生物技术公司。倒置荧光显微镜为olmpus公司产品。coulter epics xl流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培?? 　　喉癌细胞株hep2于含5%胎牛血清(fbs，北京鼎国生物技术公司产品，经56℃ 30 min灭活)，100 u/ml 青霉素及100 μg/ml 链霉素的rpmi1640培养液中单层细胞培养;37℃ 5%co2孵箱中培养传代，每次传代均以0.25%胰蛋白酶消化、洗涤1次，更换新培养基。传代浓度为5×105/ml。 　　1.2.2 一般形态学观察 　　采用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变。取对数期生长的hep2细胞以1×106细胞数接种于培养瓶中，5%fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为(12.5、25 μmol/l)的姜黄素，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)，培养48 h后，在倒置显微镜下观察并照相。 　　1.2.3 细胞凋亡荧光染色检测 　　采用ao染色法观察姜黄素对hep2细胞形态的影响。取对数期生长的hep2细胞以4×104细胞数接种于24孔板中小载玻片上，5% fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5% fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为12.5 μmol/l及25 μmol/l的姜黄素，每组药物浓度设5个复孔，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)培养48 h后，取出载玻片，磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次，滴加0.01% ao，在荧光显微镜下观察细胞形态并照相。 　　1.3 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡 　　取对数期生长的hep2 细胞以1×106细胞数接种于培养瓶中，5%fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为(6、12.5、25 μmol/l)，每组药物浓度设5个平行样，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)。分别培养24、48 h后，收集培养瓶内全部细胞，用pbs 洗涤2 次后，以冷的70 %乙醇固定，4℃条件下过夜，离心除去固定液并以pbs 洗1次，所得细胞以pi溶液〔pi 按50 mg/l溶于pbs，体积分数0.1 %的tritonx100、0.1 mmol/l的乙二胺四乙酸(edta)及