慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析的论文.docVIP

　　慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析的论文 慢性hcv感染患者pbmc体外th1类细胞因子分泌及其相关因素分析 【摘要】 目的：研究慢性hcv（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（pbmc）体外th1类细胞因子的分泌，进一步了解hcv感染慢性化和肝损伤机制. 方法：体外培养慢性hcv感染患者pbmc 72 h后，elisa检测培养上清th1类细胞因子(il2，ifnγ，tnfα)，荧光定量pcr检测患者血清hcv rna含量，rtpcr检测hcv rna亚型. 结果：与正常人相比，ifnγ在hcv rna阴性患者中明显增高，而在rna阳性患者中无明显升高. tnfα则不论rna滴度的高低均较正常人显著增高. rna阳性患者alt（丙氨酸氨基转移酶），ast（门冬氨酸氨基转移酶）水平明显高于阴性患者. 不同hcv基因型感染的患者ifnγ，tnfα的分泌无显著差异. 结论：ifnγ在清除病毒中起重要作用，tnfα是引起肝脏损伤的重要因素之一. 【关键词】 c型肝炎样病毒属 　　0引言 　　hcv（丙型肝炎病毒）感染后易于慢性化，但其慢性化机制仍不十分清楚. 有研究［1-2］表明，天然免疫、体液免疫以及细胞免疫均对病毒的清除有重要作用，而细胞免疫尤为重要. th1类细胞因子是参与细胞免疫的重要物质，在细胞清除细胞内病原体的免疫应答过程中起关键作用，但同时也是诱发肝脏损伤的重要机制. 我们比较了hcv感染后体内不同病毒滴度及不同的基因型患者的外周血单个核细胞（pbmc）体外分泌th1类细胞因子及肝脏的炎症情况，以进一步了解hcv感染慢性化和肝损伤机制. 　　1对象和方法 　　1.1对象收集我院2005年门诊或住院的慢性hcv感染患者44（男35，女9）例， 平均年龄42.3（15～67）岁，所有病例均符合2000年西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性hcv感染诊断标准［3］. 对照10例为健康献血员. 淋巴细胞提取液、trizol、细胞因子elisa检测试剂盒（晶美公司）；amv（逆转录酶），rna酶抑制剂、dntp，taq酶（promega公司）；rpmi 1640母液（gibico公司）；geneamp5700型hcvrna定量检测仪（美国abi公司）；au600肝功能检测仪（olympus公司）；其他试剂均购自北京中生公司产品. 　　1.2方法 　　1.2.1外周血pbmc的提取采用ficoll梯度离心法. 　　1.2.2pbmc体外培养后上清细胞因子的检测将分离所得pbmc用含有100 ml/l混合人血清的完全rpmi 1640培养液稀释细胞密度为5×109/l，以100 μl/孔加于96孔板，37℃，50 ml/l co2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，-20℃冻存. 同时设不加细胞的阴性对照和加入cona(刀豆蛋白，2 mg/l)刺激的阳性对照. 　　1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量pcr检测hcv rna滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成. 　　1.2.4血清hcv rna基因分型参照文献［4］进行. trizol提取血清中总rna，逆转录合成cdna，引物：5′atgtaccccatgaggtcggc3′. 巢式pcr进行rna分型鉴定. 第1轮pcr引物：正义：5′cgcgcgactaggaagacttc 3′；反义：5′atgtaccccatgaggtcggc3′，94℃变性1 min，55℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，35个循环. 第2轮pcr以第1轮pcr产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′aggaagac ttccgaggggtc3′，反义：5′tgccttggggataggctgac3′（ⅰ型，57 bp）；5′gagccatcctgcccacccca 3′（ⅱ型,144 bp）；5′ccaagagggacgggaaccta3′（ⅲ型,174 bp）；5′accctcgtttccgtacagag 3′（ⅳ,135 bp），94℃变性1 min，60℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环. pcr产物15 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定. 　　 　　统计学处理：用stata7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验. 　　2结果 　　2.1hcv感染患者pbmc体外培养72 h后th1类细胞因子的分泌培养72 h后，对照及所有hcv患者pbmc培养上清中均未检测到il2. hcv rna阴性（rnalt;106拷贝/l）患者ifnγ［（55±33） ng/l］较正常人［（34±14） ng/l ］和rna大于