携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究的论文.docVIP

　　携带AFP基因慢病毒载体制备并感染树突状细胞的实验研究的论文 【摘要】 目的: 制备携带afp基因的慢病毒, 并体外感染树突状细胞(dc) , 制备afpdc疫苗。方法: 以人hepg2肝癌细胞cdna为模板pcr 扩增出afp基因片段, 将该片段克隆入慢病毒载体, 构建成lentiafp慢病毒载体。其后, 用慢病毒载体转染293t细胞, 包装慢病毒表达载体。通过酶切、 pcr对lentiafp慢病毒载体进行鉴定。包装好的慢病毒体外感染dc, 制备afpdc疫苗, 流式细胞仪检测感染率, 免疫荧光、 rtpcr 法及电化学发光法检测afp表达。结果: 酶切、 pcr鉴定证实, 慢病毒载体插入片段为afp基因。包装的慢病毒具有良好的感染性, 可以在293t细胞中形成病毒颗粒, 携带afp基因的慢病毒感染dc, 经免疫荧光、 rtpcr法及电化学发光法证实dc能够表达转染基因afp, 并且不会影响dc表型, 感染率高达78.91%。结论: 成功构建携带afp基因的慢病毒载体, 感染树突状细胞后表达afp, 为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供了实验基础。 【关键词】 甲胎蛋白; 慢病毒; 基因转染; 树突状细胞 甲胎蛋白(alphafetoprotein, afp), 是一种重要的胚胎期及肝癌相关蛋白, 正常情况下新生儿出生后, afp表达即被关闭。但如果肝细胞发生癌变或发生化学或物理损伤时, afp基因又可重新表达。afp的表达量异常增高, 临床上可作为肝癌的一个诊断和预后指标。.cOm因此, 制备afp特异性的疫苗, 诱导针对afp的特异性的免疫反应, 可作为肝细胞癌治疗的一种新思路。树突状细胞(dendritic cell, dc)是体内功能强大的专职性抗原提呈细胞, 它能够高效的摄取、 处理抗原, 并将处理后的多肽呈递给静息型t细胞, 引起针对该抗原的特异性免疫反应。dc应用于肝癌免疫治疗是目前的研究热点, 用afp基因修饰dc, 一些方法被证实有效[1, 2]。本研究中, 我们构建了人afp慢病毒表达载体, 并应用该载体感染dc, 制备afpdc疫苗, 为dc疫苗在肝癌中的临床应用提供实验基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 慢病毒载体系统(tronolab)由中国科学院上海生化细胞所提供, 该病毒包装系统为四质粒系统, 组成为prsvrev、 pmdlgprre、 pmd2g、 pod2, 其中载体质粒pod2能表达绿色荧光蛋白(gfp)、 prsvrev、 pmdlgprre, pmd2g含有病毒包装所必须的元件。限制性内切酶bamhⅰ、 salⅰ购自takara公司。包装细胞293t细胞株购自atcc, 高感受态dh5α购自博大泰克公司, 转染用试剂trizol、 lipofectamine2000、 胎牛血清、 胰蛋白酶均购自invitrogen公司。il4 、 gmcsf及tnfα购自bioscience公司, afp肿瘤标志物检测试剂盒购自罗氏公司, 人肝癌细胞系hepg2为我科保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pcr方法获取基因片段 根据afp基因信息设计基因合成引物: 上游引物5′端带有bamhⅰ切点, 下游引物5′端带有salⅰ切点, 上游5′atttggatcccgccaccatgaagtgggtggaatcaat3′, 下游5′agacgtcgactcattaaactcccaaagcagc3′。根据说明书用trizol试剂从人hepg2肝癌细胞中抽提总rna, 并利用rtpcr 反转录成cdna, 以该cdna为模板利用上述引物做pcr扩增得到afp 基因片段 。pcr反应体系为: 模板1 μl , 10× la buffer 2 μl, dntp 2 μl, kodplus 1.0 μl , primers 1.0 μl , h2o加至20 μl反应体系。pcr反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃变性45 s、 52℃退火45 s和68℃延伸90 s, 循环数35, 最后经72℃总延伸10 min 。目的产物经琼脂糖凝胶电泳分离、 回收, 获得afp基因片段。 　　1.2.2 慢病毒载体lentiafp的构建及酶切鉴定 将pcr产物全部进行凝胶电泳后回收, 对慢病毒空载体pod2和pcr的回收产物分别用bamhⅰ和salⅰ进行双酶切, 酶切目的片段用dna 纯化试剂盒进行纯化, 再用t4连接酶将双酶切载体和目的基因片段进行连接反应。取5 μl连接产物转化入dh5α高效感受态细胞, 在含氨苄青霉素的lb 平板上37℃培养过夜。经pcr 及bamhⅰ和salⅰ双酶切鉴定后筛选出正确阳性克隆, 最后取一个正确连接的质粒送出测序进