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单宁酶及其在茶饮料中的应用 【摘　要】　单宁酶可水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，主要由曲霉属等微生物发酵生产。单宁酶防止冷混浊、提高提取率、保持色泽和减轻苦涩味的作用在茶饮料工业中有广泛的应用。 【关键词】　单宁酶；茶饮料；应用 单宁酶又称单宁酯酰水解酶（EC3.1.1.20），它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，可广泛应用于制革、酿酒、医药、饮料等领域。 1单宁酶的性质和生产 1.1单宁酶的来源和性质 单宁酶除存在于富含单宁的植物中外，还广泛存在于微生物中。能够产生单宁酶的微生物来源十分丰富，主要是真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，尤其是曲霉属中的黑曲霉、米曲霉和黄曲霉；此外，酵母菌、寄生内座壳菌、巴斯德菌、茄形镰刀菌和绿色木霉等也可产生单宁酶。 单宁酶是一种糖蛋白，不同来源的单宁酶其分子量和糖链的含量有所差异，酶蛋白由2-8个单体聚合而成，糖基含量由12%到62%不等。不同来源的单宁酶温度和pH稳定性不同：最适温度较高的50-60℃，一般在30-40℃之间，热稳定范围在60-70℃以下；来源于真菌和植物的单宁酶的最适pH一般为4.0-6.0，pH稳定性范围一般是3.0-7.0之间，细菌单宁酶的最适pH一般偏中性[2]。金属离子对单宁酶活性的影响也有所不同：Libuchi S等[3]发现许多离子对单宁酶无活化作用，但Zn2+和Ca2+可抑制酶活，另外EDTA溶液会使酶完全失活，而Aoki K[4]等发现EDTA对酶活无明显影响。Rajakumar G S等[5]发现Cu2+，Zn2+，Fe2+，Mg2+均对酶活力有显著影响。郭鲁宏等[6]研究发现除了Mn2+，Zn2+抑制酶活之外，其它金属离子对酶活均无明显的激活或抑制作用。Kar B 等[7] [41]研究表明Mg2+、Hg+ 可提高单宁酶活力， Ba2+、Ca2+、Zn2+、Hg+、Ag+ 会抑制酶活力，Fe3+、Co2+ 完全抑制酶活。 1.2单宁酶的发酵生产 单宁酶是一种诱导酶，可由微生物在单宁酸存在的条件下诱导产生的，目前对单宁酶发酵生产研究的重点多集中在曲霉和青霉上，常通过诱变育种选育和改良生产菌株以及通过优化发酵条件等途径来提高发酵产酶活力。如Libuchi等[1]以Asp oryzae为出发菌株，以单宁酶为诱导物，探讨了菌株产单宁酶的最适培养条件。Aoki K等[4]以酵母属的Candida sp K-Ⅰ为出发菌株，以单宁为诱导物，探讨了培养的最适条件，发现添加了3%的单宁所得的单宁酶积累量最多。Bradoo S等[8]对产单宁酶的日本曲霉进行摇瓶发酵培养条件优化，将酶活力提高了13%。龚加顺等[9]利用离子注入技术诱导得到一株单宁酶高产的9701菌株，其摇瓶培养的酶活力高达13.0l IU/ml，比出发菌株9401的酶活力高了2.89倍，且产酶性能稳定，重复性好；对另一株单宁酶高产菌株进行产酶条件优化后，获得了53.58mo1/s的高产酶活力。王征等[10]对黑曲霉的产酶发酵条件进行优化研究，获得316U/m1的较高酶活力。刘如石等[11]对黑曲霉NO.3菌株产酶发酵条件进行优化研究，最高酶活力可达144.25U/100mL发酵液，酶比活力为17.71。近期余钧池等[12]采用先培养菌体后再诱导产酶的方式，在诱导剂浓度为1.5%，诱导培养基初始pH5.0，30℃培养48h的条件下，发酵米曲霉得到的单宁酶活力相当于167.4U/ml发酵液。 基因工程育种具有能定向、稳定遗传、目的性强、育种周期短和能克服远缘杂交的障碍等优点，国内外都开展了构建高产单宁酶基因工程菌的研究。Hatamoto O等[13]克隆了米曲霉单宁酶的基因，用3个脱氧核糖核苷酸探针按照单宁酶N-末端和内在的氨基酸序列合成了单宁酶基因。单宁酶低产菌株米曲霉AO1被包含单宁酶基因的质粒pT1转化后，转化株的单宁酶活力增加了，且与转化的质粒数成比例。陈志仕[14]克隆并分析了米曲霉单宁酶基因序列，构建了含单宁酶基因的载体，实现了在大肠杆菌（E.coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达。郑穗兰[15]改造了重组米曲霉单宁酶基因的表达质粒，成功地进行了基因表达框架的改造，通过转化筛选获得了转化子并进行了摇瓶表达的初步摸索。ZHONG X F 等[16]研究了米曲霉单宁酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的表达，酶活力比出发菌株提高了3倍。由于天然菌生产单宁酶主要是通过曲霉属微生物的发酵获得，曲霉属发酵工艺成熟、易于大规模的培养、成本低廉、副产物少、产物分离简单，人们也对利用重组曲霉表达系统提高单宁酶的表达进行了尝试。如黄小凤等[17]利用PCR扩增得到米曲霉单宁酶基因的编码序列，然后将其连接到黑曲霉的表达载体ANED2-SP