05第5章体外技术选读.ppt

第5章 体外分析技术;;现代医学的发展疾病诊断的革新;Berson Yalow;放射免疫分析法的创立集中了放射性核素示踪技术的高灵敏度和免疫发应的高特异性;R：放射性核素标记抗原 高灵敏（10 -9~ -15 g/ml） 探测待测物上的标记信号 (标记物的放大效应);定 义; 体外分析技术是结合了放射性核素的高灵敏度和特异性结合反应的高特异性的一种超微量分析技术，具有灵敏度高、特异性强、精密度好、应用面广、方法简便等优点。;体外分析技术定量手段;生物学基础;体外分析技术; 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。 ;放射免疫分析法;基本原理;Ag;Ag;B%; 常用的有B%（B/B+F)，B/F，F/B，B0/B等这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。;;操作基本步骤;基本方法;;2.标记抗原;放射免疫技术－常用的放射性核素;125碘-标记物的制备－标记;125碘-标记物的制备－纯化;3.非标记抗原 （标准品）;;分离方法的要求;测量、数据处理;RIA小结;免疫放射分析法;IRMA与RIA工作原理的主要区别;单位点 IRMA;双位点 IRMA;B%;放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好, 常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足, RIA将逐渐被取代。;非放射性标记免疫分析技术;酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。;ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定的颜色，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。;化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。;1.化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 ;2.化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物--金刚烷，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 ;时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）;标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素;时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay）;时间分辨荧光检测的基本原理示意图;TrFIA的特点;质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有： 1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2．识别误差的来源并消除其原因。 3．改进测定方法的设计以提高质量。 ; 1.精密度（precision）同一测定方法在同样下对检测样品进行多次重复测定时，所得测定结果之间的一致性 变异系数（ CV ）一般要求变异系数15%~20%;3.灵敏度 （sensitivity） 方法的最小可测量，即在待测样品中能够检出靶物质的最小浓度;总结 体外分析的发展; 微生物 ——RMA 酶 ——REA 受体 ——RRA 特异结合蛋白