9基因定位方法探究.ppt

第七章 基因定位和图位克隆; 一、主要分子标记分类;1. 广泛使用的分子标记技术比较;2.理想的分子标记的界定;2.1 限制片段长度多态性(RFLP ，Restriction?Fragment?Length?Polymorphism);当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。 ;RFLP标记的特点;2.2 随机扩增的多态性DNA (RAPD,Random?amplified?polymorphic?DNA?);RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3‘端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。 ;通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。?;RAPD的特点：;RAPD技术假阳性率高，在实验条件不很严格的实验室，假阳性出现的机率更高； RAPD技术要求DNA纯度较高，对反应条件敏感，重复性差； 对于实验已取得的标记，必须转化成其它类型的标记，才能实现基因定位与丰富遗传图谱。 ;2.3 扩增片段长度多态性 (AFLP，Amplified restriction fragment polymorphism);使用特定的双链接头与酶切DNA片段???接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。;AFLP的特点;2.4 简单重复序列间扩增标记 (ISSR，inter simple sequence repeat);ISSR的特点;2.5 微卫星(microsatellite)或称简单序列重复(SSR，simple sequence repeat) ; SSR标记的特点;SSR 标记的优点;2.6 特定序列位点(STS， sequence-tagged site);2.7 EST (expressed sequence tags);2.8序列特异性扩增区（ SCAR，Sequence-characterized Amplified Region）;SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。若待检DNA间的差异表现为扩增片段的有无，可直接在PCR反应管中加入溴化乙锭，通过在紫外灯下观察有无荧光来判断有无扩增产物，从而检测DNA间的差异，这样可省去电泳的步骤，使检测变得方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体。相对于RAPD标记，SCAR标记由于所用引物较长及引物序列与模板DNA完全互补，因此，可在严谨条件下进行扩增，结果稳定性好、可重复性强。随着研究工作的发展，会有越来越多重要作物农艺性状的SCAR标记被开发出来，它们将在分子标记辅助育种方面发挥巨大作用。 ;3.分子标记在分子生物学研究中的应用;二、基因定位的方法 ;杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留一方染色体而人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠类细胞都有各自不同的生化和免疫学特征，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡。从而推断TK基因定位于第17号染色体上。这是首例用细胞