实时荧光定量PCR技术及其在微生物群落丰度研究中的应用.doc

PAGE  PAGE 8 宁波大学硕士研究生 2009 / 2010学年第一学期期末考试卷 考试科目： 实验生态学 课程编号： 07G13104A 阅卷教师： 陆开宏 姓 名： 周金梅 学 号： 0911071146 成 绩： 81 实时荧光定量PCR技术及其在微生物群落丰度研究中的应用 周金梅 （宁波大学09级海洋生物学专业，曹光彪科技楼314室，浙江宁波，315211） 摘要：从1983年Mullis发明聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）后，PCR技术迅速成为分子生物学试验的热点技术，实时荧光定量PCR技术在此基础上，把核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和常规PCR技术结合在一起，成为近些年来发展很快的一门新技术,并且在海洋微生物生态细菌丰度的研究中得到了广泛的应用。 关键词：实时荧光定量PCR；PCR；海洋细菌丰度 海洋约占地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%[1]，其中蕴藏着丰富的微生物资源，海洋微生物作为海洋生物的一个组成，有其独特的特性。目前，海洋生物资源的开发利用日益受到国家的重视[2]，海洋生物由于海洋环境的复杂性能够产生很多陆地生物所不具有的活性物质，已经被科技界认可[3，4]。现在海洋微生物资源研究已经成为海洋研究的重要内容之一，海洋微生物相对于陆地微生物来说，对高盐，高压，低养，低光照等极端环境的耐受能力更强一些，据估计海洋微生物可达0.1-2亿种[5]。为充分利用海洋微生物资源，研究海洋微生物群落的组成，确定海洋微生物群落的优势类群或具有某些生物学功能的微生物类群的丰度是非常必要的。然而海洋中许多环境微生物是不可培养的，目前研究主要局限于那些在常规条件下易于培养的微生物类群，这给人们的研究带来了一些障碍。而近几年来包括PCR在内的许多分子生物学方法， 提供了不依赖于传统微生物培养方法的新技术，为人们对海洋环境微生物群落的组成和丰度的研究提供了新的技术支持。实时荧光定量PCR技术是一种核酸定量的新技术， 该技术具有高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、污染少等优点，并且在微生物生态学研究中得到了广泛的应用[6，7]。实时荧光定量PCR技术与其他的分子生物学技术的联合使用， 使我们可以不仅定性的， 而且也可以定量的研究海洋环境中微生物群落结构组成及群落丰度的变化,更加深入的探索微生物群落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。为海洋微生物资源的合理利用提供更多理论依据。本文试就其定量原理、方法、参照及在海洋微生物群落丰度方面的应用作一介绍。 1实时荧光定量PCR技术概述 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司率先推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度又快、全封闭式的反应环境等优点，有效解决了常规PCR交叉污染、出现假阳性或阴性等问题，目前已广泛应用于分子生物学等领域[8]。 1.1实时荧光定量PCR技术的原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增[9]。在扩增反应结束之后，可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。但是在许多情况下，我们要研究的是未经PCR信号放大之前的起始模板量，而实时荧光定量PCR技术可以测模起始量。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-time RT-PCR）实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测[10]。用于实时扩增的探测化学物质有5种主要类型，包括：内嵌染料、双标记探针、FRET探针、分子信标、Ampliflor，常用的有两种，即内嵌染料型和双标记探针型。内嵌染料一般常用的是SYBR-Green I，双标记探针是5，末端连接有荧光报告染料，3，端连接有荧光淬灭分子的一种短的寡核苷酸序列，常用的探针是TaqMan荧光探针[11]。 1.1.1内嵌染料型（SYBR-Green I）原理 SYBR-Green I荧光染料：SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 5