MTT配制_原理_操作步骤_结果分析_注意事项.docVIP

MTT 实验操作步骤 收集对数生长期细胞制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。（MG63/DOX and SF-86 细胞都是这个浓度）。 细胞悬液吹打均匀后，用排枪接种到96孔板，每孔100ul(即5000个细胞)。 种完细胞后6—24小时后，等其完全贴壁，将排枪调至130ul，将上清液培养基吸出（吸取过程中要动作要轻，沿孔壁至每孔的左下角，枪尖不要在底面滑动，防止损伤细胞）。 用完全培养基将药物按梯度配制好，每孔加入含药培养基150ul，孵育72小时（每个药物做3个复孔）。 72h后，将排枪调至180ul，将上清液培养基吸出，每孔加入50ul 0.5mg/ml的MTT溶液，孵箱内孵育4小时。（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS缓冲液配制成5mg/ml，超声溶解后过0.22ul微孔滤膜除菌，4℃保存，此为MTT母液，母液四度可保存一月，配制时注意不要配太多！！实验中MTT溶液为MTT母液10倍稀释与不含血清培养基，e.g. 如果需要10mlMTT溶液，取1ml 母液加9ml 不含血清培养基） 4h后，排枪调至80ul，将上清MTT溶液吸出（注意不要损失底面的紫色结晶），每孔加入150ul DMSO 溶液，孵箱内孵育1小时，以便结晶完全溶解。 读板器读板（读板前注意观察紫色结晶是否完全溶解） 读板设置为570nm 跟650nm 两波长读数，输出OD值为570nm处读数-650nm处读数。 e.g. cell plate: 　　　　　　　　　　　　DRUG 1controlcontrol0.10.20.40.81.63.26.412.8ug/ml　controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　DRUG 2controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Result: 0.07720.24760.24440.23940.19910.17840.16170.13760.10280.09660.08420.07750.07440.31080.29420.26830.23870.22390.18910.17370.12890.10630.09660.07650.0760.31110.31850.28990.24720.21750.20480.16280.13670.11110.0940.07880.07240.31040.3190.27470.25130.22270.21440.16580.14390.11780.09380.07860.07850.31520.30390.28320.26110.23030.1930.16780.15060.10820.07970.07540.07230.28830.3140.28640.25910.22830.20230.15650.1510.1230.09810.08080.07410.26440.29280.28480.27170.20650.18520.15660.14410.12040.08990.08340.0790.28460.26470.27430.22550.19530.17590.16440.14050.10830.08440.0832MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项 - 一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。（可参考Sigma，货号 M5655， Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）二、MTT法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（F