TIANGEN产品DP304_血液、组织、细胞基因组提取试剂盒_DP122121.docVIP

使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW加入相应体积无水乙醇，并在瓶身上标识！ 1.处理材料 a. 如提取材料为血液，可直接使用200 μl现用300ul，保证提取出的DNA量，但鉴于300ul需要红细胞裂解液，有待考究。建议仍用200ul 新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200 μl可加缓冲液GA补足； 注意：如需处理更大体积血液，如300 μl-1 ml，应按以下步骤操作：在样品中加入3倍体积红细胞裂解液 （例如，300 μl血液加入900 μl红细胞裂解液），颠倒混匀，室温放置5 min，期间再颠倒混匀几次。10000 rpm(~11,500×g)离心1 min（若离心 机最高转速不允许，可3000 rpm(~3,400×g)离心5 min），吸去上清血清 ，留下白细胞沉红细胞在最下层，接着是白细胞和血小板，最上面血清 淀，加200 μl300ul？？？ 缓冲液GA，振荡至彻底混匀。 红细胞裂解液本公司另外有售（目录号：RT122），可根据需要来决定购买。 b. 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量5-20 μl，可加缓冲液GA补足200 μl300ul？？？ 后进行下面的裂解步骤。 c. 贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液，然后10,000 rpm(~11,200×g)离心1 min，倒尽上清，加200 μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮； d. 动物组织剪刀尽可能剪碎，越碎越容易被蛋白酶K消化 （脾组织用量应少1 0 m g）应先打碎处理为细胞悬液，然后10,000rpm(~11,200×g)离心1 min，倒尽上清，加200 μl300ul 缓冲液GA悬浮细胞 ，振荡至彻底悬浮。 注意：如果需要去除RNA，可加入4 μl RNaseA（100 mg/ml）溶液依建库要求添加 （客户自备，目录号：RT405-12），振荡15 sec，室温放置5 min。 2. 加入20 μl前面用300ulGA溶解组织，这里就用30ul蛋白酶K来溶解 Proteinase K使组织分解成单个细胞，悬浮细胞，溶解蛋白 溶液，混匀。 a. 提取血液基因组时，只需加入Proteinase K混匀，即可继续进行下一步。 b. 提取细胞基因组制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。 时，只需加入Proteinase K混匀，即可继续进行下一步。 c. 提取组织基因组时，加入Proteinase K混匀后，在56℃放置，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。 注意：不同组织裂解时间不同，通常需1-3 h即可完成（鼠尾需要消化过夜）。不会影响后续操作。每小时颠倒混合样品2-3次，用水浴振荡器也可。 3. 加入200 μl300ul 缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 注意：加入缓冲液G裂解细胞，分离核算和蛋白质 B时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不 纯。当血液体积≤200 μl且没有采用红细胞裂解处理，或是样本储存条件不佳，水浴后颜色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀。 4. 加人200 μl300ul 无水乙醇沉淀核酸 ，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液将吸附柱CB3放回收集管中。 6. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD洗掉蛋白 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW洗去盐离子 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8. 重复操作步骤7。 9. 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟通风橱，吹干5min ，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10. 将吸附柱