双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体基准的操作规划.doc

八五三农场职工医院检验科文件编号：BWS-07-01-001 作业指导书 第 1 页 共 3 页第 3 版 第 0 次修订文件名称：双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程实施日期：2007-7-11 双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程 1、目的 规范抗-HIV抗体检测操作程序。 2、适用范围 本实施细则使用于对人类血清或血浆中艾滋病毒抗体的初筛检测。 3、原理 采用夹心ELISA方法检测血清或血浆样品中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗体，预包被高纯度重组HIV（1+2型）抗原，待检血清中的抗HIV抗体与包被抗原反应，再与酶标HIV-1+2型抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，加底物（TMB）显色，在酶标仪上测定OD值，根据OD值判定有无HIV抗体的存在。 4、环境条件 室温18-25℃。室内相对湿度30-60％ 5、试剂与材料 5.1、吸水纸； 5.2、说明书1份； 5.3、HIV抗原包被板1块，每板12条，每条8孔； 5.4、HIV酶标抗原工作液1瓶； 5.5、50倍浓缩洗液1瓶； 5.6、HIV阳性对照（已灭活）1支； 5.7、HIV阴性对照1支； 5.8、底物液A 1瓶； 5.9、底物液B 1瓶； 5.10、终止液1瓶； 5.11、封口胶2张； 5.12、塑料袋1个； 5.13、（新鲜）蒸馏水或去离子水； 5.14、一次性V型水槽； 5.15、一次性瓶（塑料），用于准备TMB底物液； 5.16、一次性乳胶手套； 5.17、记时器； 5.18、5％次氯酸钠或其他认可消毒液； 5.19、适用盛装有可能受污染的物品的容器； 5.20、尿过氧化物溶液2瓶，每瓶11ml。 6、仪器 6.1、酶标仪； 6.2、水浴箱（35-39℃）； 6.3、离心机； 6.4、洗板机； 八五三农场职工医院检验科文件编号：BWS作业指导书第 2 页 共 3 页第 3 版 第 0 次修订文件名称：双抗原夹心ELISA方法检测艾滋病病毒抗体标准操作规程实施日期：2007-7-11 6.5、打印机。 7、操作步骤 7.1、使用前将试剂盒从冰箱中取出平衡至室温，取出所须板条，剩余的及时封存放回冰箱。 7.2、每次实验均须设立空白对照孔2孔，不加样品和酶结合物，只加底物和终止液；抗-HIV阳性对照孔3孔，每孔50或100μl。 7.3、其余各孔加待检测标本50或100μl。 7.4、覆盖粘胶纸，置37℃孵育30或60分钟。 7.5、将50倍浓缩洗液用纯化水50倍稀释后备用。 7.6、取出已孵育完毕的反应板，弃去粘胶纸，放入洗板机中，吸干板内液体，将洗涤液注满酶孔（约300μl/孔），吸干，反复5次，在干净纱布上将板拍干。 7.7、除空白孔外，每空加入酶标抗原工作液50或100μl，贴上封口胶。37℃温育20或30分钟。 7.8、洗涤同步骤7.6。 7.9、每孔加入底物缓冲液A50μl、TMB B50μl，混匀，置37℃显色10分钟。 7.10、加终止液50μl振荡反应板5秒种，使之充分混匀。 7.11、在酶标读数仪中，取波长450nm（建议使用双波长酶标仪比色，参考波长630nm），以空白对照孔校零，读取每孔吸收值（加终止液后，务必在15分钟内读数完毕）。 8、质量控制与评价 8.1、抗HIV阳性对照OD值＞0.8，抗HIV阴性对照OD值＜0.08或0.12。 8.2、阳性对照OD值有效范围：≥0.50。 8.3、阴性对照OD值有效范围：≤0.10。 8.4、阴、阳性对照和被检样本的OD值减去空白对照OD值即为计算值。 8.5、临界值（CUT OFF）=0.10或0.15+阴性对照OD均值。 8.6、样品OD值≥临界值者为HIV抗体阳性，初试阳性应重新取样双孔复试，复试阳性者应按照“全国HIV检测管理规范”送“HIV确认实验室”进行确认实验。 8.7、样品OD值≤临界值者为HIV抗体反应阴性。 8.8、阴性对照值若小于0.02，以0.02计算。 8.9、被检样本的OD值≥临界值判为HIV抗体阳性。 8.10、每次实验必须做外部质控。 8.11、质控血清有明确的标记，保存-20℃以下。 9、说明 9.1、本试剂的使用单位必须是经当地卫生部门批准的HIV初筛实验室。 9.2、整个检测工作必须符合HIV实验室管理规范和生物安全守则规定，严格防止交叉感染。 9.3、标本和酶结合物均应加样器加注，并经常校对其准确性。 9.4、所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按传染物处理。 9.5、洗涤液若出现结晶，可置37℃溶解。 9.6、粘胶纸不能反复使用。 9.7、微孔条从冷藏环境中取出时，应在室温平衡至无潮气方可使用，未用完的须放入有干燥剂的密封