自身抗原PDCE2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学的论文.docVIP

　　自身抗原PDCE2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学的论文 【摘要】 目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdce2）融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（pbc）的早期发现和临床诊断。方法：针对pdce2的cdna序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取rna，通过反转录pcr方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pet28a(+)，构建重组表达载体pet28a(+)pdce2，转化大肠杆菌bl21(de3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经sdspage、am2）的免疫原性。结论：获得pbc特异性靶抗原的多肽片段，为pbc的早期发现和临床诊断提供有力工具。 【关键词】 pbc 自身抗原 pdce2 重组融合蛋白 　　the cdna cloning and expression of autoantigen pdce2 　　zhou ye, yao dingkang, chen yan, jiang tianshu, jiang tingei. 　　laboratory diagnostics, changzheng hospital,second military medical university,and clinical immunology center of pla, shanghai 200003, china 　　［abstract］ objective:to express pdce2 rebinant fusion protein in e.coli.methods:the cdna encoding pdce2 ed by dna sequencing, subcloned indirectionally into the bacterial expression plasmid pet28a(+) and then transformed into e.coil. bl21(de3) to express the rebinant fusion protein induced by iptg.results:the rebinant fusion protein exhibited the antigenicity of amam2 by ary biliary cirrhosis，pbc）是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征、最终导致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾病（aid）［1，2］。.pbc患者体内可出现多种自身抗体，其中最主要的是抗线粒体抗体（ama）。ama分为m1～m9共9个亚型，而只有m2为pbc特异抗体。amam2抗体对pbc检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达100%［3］。m2抗体的靶抗原为线粒体上的2氧酸脱氢酶复合体（2oadc）的一些组分：丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdce2）、2氧酸脱氢酶复合体e2（bcoadce2）、2氧戊二酸脱氢酶复合体e2（ogdce2）等。其中pdce2是与m2反应的最主要靶抗原，pdce2的抗原表位主要位于内酯酰区和部分外酯酰区。我们用基因工程的方法表达pdce2融合蛋白，为pbc的早期发现和特异性诊断提供有效手段。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 血清标本 12例病人血清来源于本院住院病人，经德国euroimmun公司免疫印迹试剂盒测定，m2抗体为阳性；12例正常人血清来源于本院健康体检者。 　　1.1.2 主要试剂 反转录酶、pcr扩增试剂盒、rna提取试剂盒为qiagen公司产品；各种限制性内切酶、t4dna连接酶购自takara公司；pet28a(+)质粒及大肠杆菌bl21(de3)购自novagen公司；间接免疫荧光法测定ama试剂盒购自euroinmun公司。 　　1.1.3 引物 参照人pdce2全序列，设计了扩增pdce2内酯酰区和部分外酯酰区的引物。pdce2正向引物：5′ttcgccgtgcaaaaattatacactggtatcctg3′；pdce2反向引物：5′acagctgtgagctctaaatctgttacttcggttg3′。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因克隆操作 用淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离单个核细胞，得到的白细胞抽提rna，反转录得到cdna。pet28a(+)质粒用node ⅰ和ecor ⅰ双酶切后、经t4dna连接酶的作用将pdce2的cdna定向插入其中，送上海生工生物工程技术公司测定序列进行鉴定。pcr扩增反应条件为94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环后再进行72℃延伸5分钟。 　　1.2.2 重组质粒的转化和鉴