血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建的论文.docVIP

　　血管生成素1和报告基因EGFP双基因共表达腺病毒的构建的论文 作者：孟国林，段春光，刘建，吕昌伟，杨旻，袁志，胡蕴玉 【摘要】 目的：构建并制备血管生成素1和egfp双基因共表达重组腺病毒载体. 方法 ：采用基因克隆技术克隆目的基因ang1，并将得到的基因亚克隆至含有报告基因egfp的穿梭载体padtrackcmv；使用padeasy1腺病毒系统将含有目的基因的穿梭载体与腺病毒骨架质粒在细菌bj5183中同源重组，产生重组腺病毒载体；线性化重组的腺病毒转染入qbi293a细胞中对重组的腺病毒进行包装并扩增. 结果：ang1基因与腺病毒穿梭载体连接成功，经xho i/ecor v双酶切后琼脂糖电泳可见在1.5 kb处出现特异性条带，证明padtrackcmvang1重组质粒构建成功；重组的穿梭载体与padeasy1质粒重组后，产物经pac i酶切后琼脂糖电泳可见一大一小两个片段. 大小约为30 kb和4.5 kb，与预期结果相符，证明重组腺病毒padang1egfp构建成功；线性化重组的腺病毒转染入qbi293a细胞后包装成功. 扩增后病毒滴度为2×1014 v.g./l，egfp活性检测腺病毒感染细胞阳性率在30%以上. 结论：成功制备了padang1egfp腺病毒. 为骨组织工程血管化的 研究 打下基础. 【关键词】 血管生成素； 腺病毒； 基因转染； 增强型绿色荧光蛋白 0引言 大段骨缺损的修复一直是临床上难以解决的难题，而缺乏足够的血运是其难以修复的重要原因. 因此血管化的研究在大段骨缺损的研究中显得极为重要. 血管的形成可分为血管发生和血管生成，成熟个体形成血管的唯一方式是血管生成，而ang1在这一过程中起着重要的调节作用［1-2］. 所以对于ang1的研究对于大段骨缺损的 治疗 显得极有意义. 本研究中， 我们设计、 构建了携带ang1基因的腺病毒（adenovirus）， 为探索大段骨缺损的血管化打下了基础. 1材料和方法 1.1材料pcdna3.1(+)真核表达载体由本室保存，质粒padtrackcmv(含egfp基因)、padeasy1, 菌种bj5183购自stratagene公司；293a细胞株、转染试剂(lipofectamine 2000)购自invitrogen公司. 各种限制性内切酶，t4连接酶、反转录酶primescripttm reverse transcriptase, dna聚合酶（primestartm hs dna polymerase）, pmd18t vector购自takara公司. 质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自（omega biotek）公司,mrna提取试剂（polyatract system 1000）,mmlv购自promega公司. 1.2方法 1.2.1血管生成素1 （ang1）基因的克隆及鉴定①在genebank上查询ang1的序列为nm_001146. 根据此序列设计引物. 引物序列为：f: ccgctcgag atgacagttttcctttcc, r: tttgatatctcaaaaatctaaaggtcg上游引物引入xhoⅰ位点，下游引物引入ecorⅴ位点. ②rna的提取及cdna的获得：使用polyatract system 1000试剂盒从胎盘组织中提取mrna提取步骤按照说明书进行，将提取的mrna使用反转录酶primescripttm reverse transcriptase反转录为cdna，步骤按照说明书进行. ③pcr扩增ang1 基因片段：以上述获得的cdna为模板，进行pcr反应. 反应条件为98℃ 10 s, 65℃ 5 s, 72℃ 2.5 min. 35个循环. 琼脂糖电泳鉴定. ④ang1克隆入pmd18t vector，dna测序鉴定：将pcr产物进行凝胶回收纯化后，克隆至pmd18t vector中，将质粒pmd18tang1转化至细菌dh5α中，扩增后送公司测序. 1.2.2携带ang1基因和报告基因egfp 的腺病毒载体的构建①将基因ang1克隆至腺病毒穿梭载体padtrackcmv：质粒pmd18tang1和穿梭载体padtrackcmv（含有基因egfp）分别进行xhoⅰ/ecorⅴ双酶切，产物胶回收后，按15∶1比例混合，加入t4连接酶进行连接. 转化入细菌dh5α，提取克隆进行酶切鉴定. ②病毒的重组：先将腺病毒骨架质粒padeasy1转化入细菌bj5183中，得到含有padeasy1的bj5183细菌，将鉴定正确的携带目的基因ang1的穿梭载体转化入含有padeasy