抗体选择原则_副本.docxVIP

抗体的选择： 在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好，不宜同源。 二、一抗、二抗的选择原理及方法 1. 一抗选择要点（从兔血清里制备的叫兔源多克隆抗体） （1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。 （2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明 书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的 抗体。 （3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。 （4）样本蛋白的结构性质。了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。 （5）单多克隆抗体的选择。市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。 2. 二抗选择要点 （1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。 （2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。 只是生产商在检测时使用了不同的种属不同的样品类型，或是参照了不同的文献，对使用者来说，同样的样品，不管使用哪个品牌的，只要抗体是对的，目的条带只会出现在相同的位置。关于分子量的问题，一般不建议看产品说明，WB中条带的位置由样品决定，并不会因为抗体不同而不同。所以在检测蛋白之前，我们可以通过数据库或参考文献，对将要检测的蛋白做个比较全面的了解，包括其可能剪切与修饰的情况、表型的情况等。在第一次使用一个新的抗体时，不要根据分子量横向剪膜，可以保留几个全泳道，看看条带位置或分布的情况。 抗体的保存： 抗体无论是保存还是运输都应尽可能地避免反复冻融，收到抗体后请根据实验的需要，对抗体进行分装，避免同一管抗体反复冻融（反复冻融会导致抗体空间结构变 性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力）。抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果，如果抗体保存得当，抗体活性大部分都可以维持数年。 请谨记，无论何时请按照说明书推荐的保存条件正确处理和保存抗体。 （1）收到抗体后，请务必在4℃，12000rpm，离心3分钟，（无论是液体还是冻干粉状态），再打开管盖进行分装和保存（如果抗体体积小于50ul，请延长 离心时间至5分钟，以保证全部抗体均离心下来）。抗体一般使用特制的储存管，只有在12000rpm离心3分钟，才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下 来（即使是在10000rpm离心也会离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象）。 （2）对于大部分抗体，比较合适的保存方式是，分装后保存在-20℃或者-80℃。 5）抗体工作液应该当天配制当天用完，4℃保存尽量不要超过1天。 6）绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中，将抗体保存在冰箱里层，避免温度变化造成反复冻融。 （3）大部分抗体收到后4℃短暂保存1~2周对抗体活性没有影响。 （4）大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1~2周的时间，所以是在低温4℃的条件下来完成的。 4℃运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害（如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻，这就多了一次冻融的过程），所以运输过程中绝对避免干冰运输。 抗冻剂：甘油和乙二醇 冰晶的形成能够破坏蛋白质的结构，因此导致抗体失效。甘油或乙二醇等防冻剂可以防止水分子之间氢键的形成，加入到溶液中可以降低其的凝点。 注意： 乙二醇是有毒性的，使用的时候一定要注意安全。 当储存温度低于抗体溶液真实的凝点的时候，抗体溶液就会凝固。但是，这个时候并不会形成冰晶，而是发生了玻璃化作用，其可以保持抗体结果完整性。 为了增加抗体的稳定性，可以向抗体中加入终浓度为50％的甘油或乙二醇储存于-20℃。通常为了避免反复冻融，可以分装抗体。因为普通甘油中含有微生物污染，所以使用无菌的甘油显得尤为重要。 灭菌和杀菌剂 抗体制剂应通过使用0.45微米的过滤器过滤和消毒的，并且其必须进行无菌处理，以防止微生物污染。 所以储存这类抗体和制剂的时候加入蛋白酶抑制剂尤为重要。冷藏和/或加入蛋白酶抑制剂可用于防止