转基因显微注射中的基因装液方法的论文.docVIP

　　转基因显微注射中的基因装液方法的论文 【关键词】 动物 遗体修饰 小鼠 转基因 显微注射 基因转移技术 　　目前常用的转基因动物制备方法有显微注射法、逆转录病毒感染法、精子载体法、胚胎干细胞介导法、人工酵母染色体法及电转移法等[16]。其中显微注射仍是最可靠、最广泛使用的一种方法,因其外源基因整合效率高,对目的基因无大小限制,且可以直接获得纯系[78]，但其过程烦琐且要求严格,将基因液装入微注射针是其成功的关键前提[910]。当前各实验室普遍使用可编程微量注射仪,该仪器要求将基因液面倒吸至注射针的直管部以获得稳定平衡压力,但仅用其吸入功能无法达到,导致培养液倒吸,基因液被稀释,从而大大影响了转基因成功率。笔者建立一种简单有效的方法以克服这一缺点。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器和材料 pn30拉针仪,mf900煅针仪,im300可编程微量注射仪（日本narishige公司）；倒置显微镜,显微操作仪（日本olympus公司）,g100薄壁毛细玻璃管（1×90 mm,日本narishige公司）或bj40薄壁毛细玻璃管（1.0×100 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,玻璃管（2.5×200 mm,北京正天易科贸有限责任公司）,一次性培养平皿（美国bd falcon公司）,显微注射用基因液,m2培养液,石蜡油（m8410,美国sigma公司）。 　　1.2 仪器参数 　　1.2.1 注射针 拉针仪：主磁61，副磁23；温度70 ℃；煅针仪：弯针温度20～25 ℃。.cOm 　　1.2.2 可编程微量注射仪 input：60～100 psi（1 psi=6.895 kpa）；clr：60～70 psi,0.1 s；baln：0.8 psi；fill：60 psi,60 s；inj：0.5～0.8 psi,0.02 s。 　　1.3 方法 　　1.3.1 注射针制备 设定对应的拉针仪参数,装上毛细玻璃管,用固定旋钮固定好,按下拉针仪开关,将其拉制成开口小于1 μm的注射针；取下注射针装在煅针仪的持针架上,将注射针移至玻璃球侧面,使其内径20 μm处靠近玻璃球,设定好煅针仪的温度参数,点压加热开关,将其弯成25°。 　　1.3.2 微载管制备 用两把镊子夹住直径为2.5 mm的玻璃管两端,将其中部置于酒精灯火焰上灼烧,待其软化后,快速向外拉伸。在距肩部约9～10 cm处用砂轮裁断细部,将细部的尖端在锻针仪上锻烧,使开口边缘变光滑。这样制备的微载管外直径约200～400 μm,用于将石蜡油装入显微注射针。 　　1.3.3 基因液的装载及比较 将相同参数下制备的注射针分成2组,每组3根,分别按照下面2种方法将基因液装入针内。 　　 针尖倒吸法（a法） 将注射针装到显微操作仪持针器上,并与可编程微量注射仪相连接,调好可编程微量注射仪各部分参数,打开“baln”功能；在培养皿盖子上作一个3 μl基因液液滴,覆盖上石蜡油,将其置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,使其进入基因液滴,按下注射仪的“fill”按键,将基因液倒吸进入注射针,按下注射仪的“fill”按键数次,观察注射针内液面的变化。 　　 改良法（b法） 用微载管吸取少量（约5～10 μl）灭菌石蜡油并从显微注射针的背部注入,直到液面到达注射针的直管部（图1）,小心取出微载管,通过橡胶管将注射针背部与注射器相连,按压注射器活塞对石蜡油轻轻施压,使得针内液面向针口缓慢移动,最终充满整个注射针尖部；后续操作同。 　　图1 显微注射针各部分示意图（略） 　　fig 1 representation of each part of microinjection pipette 　　1.3.4 显微注射模拟及比较 　　 平衡压力的观察 保持显微注射仪所有参数不变,将m2培养液装填于3.5 mm培养皿盖并置于倒置显微镜的载物台上,调整注射针角度,驱动显微操作臂使其缓缓下降进入m2培养液中,在倒置显微镜20×物镜下调节焦距至基因液液面清晰,观察注射针内基因液液面的位置变化,以判断此时显微注射仪提供的平衡压力是否能够抵消培养液的虹吸效应,产生使基因液缓慢外流的正压。 　　 模拟注射后液面变化 保持显微注射仪所有参数不变,调好注射仪的“inj”功能,反复按压“inj”按键模拟显微注射过程＞30次后,按压“clr”按键10次,在倒置显微镜20×物镜下观察注射针内液面变化情况。 　　 液面变化数值统计学处理 调节焦距至基因液液面清晰,记录此时基因液液面在目镜测微尺上的刻度（起始位置）,10 min后再次观察并记录液面在目镜测微尺上的刻度（终止位置）。将2组注射针内基因液液面在10 min的位置变化差值进行统计分析,并作配对资料t检验,采用microcal origin 3.