过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响的论文.docVIP

　　过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响的论文 过表达gnb2l1基因对体外节律基因mper1表达的影响 【关键词】 时间生物学;节律基因;gnb2l1基因;per1基因;转染 【摘要】 目的：评价过表达gnb2l1基因对节律基因mper1表达的影响。方法：用pma刺激nih3t3细胞，使节律基因稳定表达后，用脂质体介导方法将质粒pcdna3.1/gnb2l1转染至nih3t3细胞，并以空载体质粒pcdna3.1/vector为对照。利用rtpcr技术检测不同时间点gnb2l1 mper1在nih3t3细胞中的表达水平，研究过表达gnb2l1基因对mper1基因表达的影响。结果：采用rtpcr技术显示成功转染，实验组比对照组的gnb2l1表达量明显增高(plt;0.05)。并且发现实验组的mper1表达量比对照组明显增高，但是经过余弦分析发现两组相比mper1的表达周期无明显改变。结论：成功过表达gnb2l1基因使节律基因mper1表达量增加，中值增高(p=0.038)。 【关键词】 时间生物学;节律基因;gnb2l1基因;per1基因;转染 生物体普遍存在调控生命活动约为24 h的近日节律[1]。mper1为近日节律振荡器的核心组件，mper1转录产物的磷酸化和入核在近日节律的产生和调控中起重要作用。.cOmperiod1(per1)是近日节律系统中的核心蛋白,并且与机体其他功能诸如药物依赖、肿瘤发生等[2-3]密切相关。gnb2l1是一个看家基因，在细胞接受刺激的时候，gnb2l1基因能够迅速作出反应，编码合成rack1蛋白，实现基因的转录调控以及转录后水平调控，并进一步引发一系列迟发反应。前期研究表明rack1蛋白为per1相互作用的节律相关蛋白，上调及下调per1基因并未影响rack1的基因转录和蛋白表达[4]。因此推测rack1并非per1的下游钟控蛋白，rack1可能通过参与/介导per1相关的信号分子通路，进而影响per1节律及其他功能的实现。因此本文研究过表达gnb2l1发现mper1表达量明显增高，可以推测gnb2l1可能是mper1的上游钟控基因。进一步揭示生物节律信号通路的分子机制、研究rack1与per1的功能联系提供了基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株 nih3t3细胞由华西医学中心微生物教研室馈赠。 　　1.2 试剂 dmem培养基(hyclone)，小牛血清(hyclone)，青霉素(华北制药厂)，链霉素(华北制药厂)，胰蛋白酶(宝信生物公司)，pma(phorboll 2myristate 1 3acetate，promega)，trizol(invitrogen)，rtpcr一步法试剂盒(takara)，taqdna polymerase(tiangen)，lipofectamine 2000(invitrogen)，质粒抽提试剂盒(giagene)。 　　1.3 细胞培养及诱导 细胞于含10%小牛血清、100u·ml-1青霉素及100 u·ml-1链霉素的dmem 培养基中，5%co2孵箱内37℃静置培养。nih3t3细胞按每孔2×105个细胞接种于十二孔板，待细胞12h贴壁后，更换新鲜培养基(每孔1.98ml)，每孔加pma 20μl，终浓度为100 nm·l-1。 　　1.4 转染 pma刺激24h后，按照脂质体lipofectamix 2000说明书，将pcdna3.1/gnb2l1质粒转染nih3t3细胞(a组)，以pcdna3.1/vector质粒转染细胞为对照(b组)。转染12h后，每隔2h分别收集实验组和对照组细胞各3孔，共收集48h，24个时间点。 　　1.5 rtpcr检测gnb2l1， mper1的表达 trizol法提取细胞总rna，采用半定量rtpcr法特异性扩增gnb2l1和mper1mrna，分别与内参积分光密度(od)值相比来分析gnb2l1和mper1mrna相对表达水平。引物由invitrogen 公司合成，序列见表1。 　　1.6 统计分析 实验结果以(x±s)表示。采用t检验进行比较，以plt;0.05为差异具有 统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 过表达效率的鉴定 　　rtpcr产物电泳结果见图1。用gelpro analyzer软件，分析gnb2l1及βactin，经rtpcr所得条带的(od)值，计算rtime=odgnb2l1/odβactin，如图2所示。图中可以看出实验组的gnb2l1表达量比对照组明显增高(plt;0.05)。表1 引物序列　　 　　2.2 rtpcr测定过表达gnb2l1基因对节律基因mper1表达的影响 　　过表达gnb2l1基因转染后可导致节律基因m