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　　银杏叶提取物对内皮细胞的保护作用的论文 银杏叶提取物对内皮细胞的保护作用 【关键词】 银杏叶提取物;内皮细胞;细胞增殖;akt 【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物(gbe)对血管紧张素ⅱ(ang ⅱ)致体外培养人脐静脉内皮细胞(huvec)损伤的保护作用。方法 将处于对数生长期的huvec分为正常对照组、angⅱ组及高、中、低3个gbe处理组，其中正常对照组用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养，ang ⅱ组在正常对照组培养基基础上含ang ⅱ 10-8mol/l，gbe处理组在angⅱ组基础上分别加gbe 50、100、200 mg/l做为gbe低、中、高组，采用mtt法测定培养细胞增殖能力。并应用tt法检测结果表明，ang ⅱ组细胞增殖能力明显高于正常对照组(plt;0.05)，除gbe低剂量组外，gbe高、中剂量组a值均明显高于ang ⅱ组(plt;0.05);em培养基和小牛血清均为gibco公司产品;舒血宁(每支2 ml，折合gbe为7.0 mg，其中含总黄酮醇苷1.68 mg，含银杏内酯0.28 mg，批号：031209)为三九药业有限公司产品;兔抗人磷酸化蛋白激酶b(akt)、三磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)均为santa cruz产品;辣根过氧化物酶(hrp)标记羊抗兔igg为北京中衫金桥公司产品;聚偏氟乙烯(pvdf)膜及化学发光检测(ecl)试剂盒为millipore产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 huvec传代培养 　　冻存huvec复苏后，接种至25 cm2培养瓶， 待细胞生长汇合时，常规进行传代培养，隔日更换细胞培养液1次。 　　1.2.2 实验分组 　　将处于对数生长期的huvec分别用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养24 h后，分为5组，分别为正常对照组，ang ⅱ组及高、中、低3个gbe处理组。其中正常对照组用含0.5%小牛血清的dmem培养基培养，ang ⅱ组在正常对照组培养基基础上含ang ⅱ 10-8 mol/l，gbe处理组在angⅱ组基础上分别加gbe 50、100、200 mg/l做为gbe低、中、高组。 　　1.2.3 培养细胞增殖能力测定 　　采用噻唑蓝(mtt)法测定培养细胞增殖能力。将细胞消化后，用含10%小牛血清的dmem培养液配成单个细胞悬液，以1×103个/孔接种至96孔板，每孔加培养液150 μl，培养24 h后小心弃去上清，按1.2.3分组情况分别加入条件培养基150 μl，每组设4个复孔。37℃、5% co2培养箱中培养24 h后，每孔加入mtt溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清，每孔加入150 μl 二甲基亚砜(dmso)，震荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490 nm处测定各孔吸光度值(a)。 　　1.2.4 ol/l trishcl(ph7.5)，0.1 mol/l nacl，0.001 mol/l乙二胺四乙酸(edta)，100 μg/ml苯甲基磺酰氟(pmsf)，1 μg/ml aprotinin〕反复吹打，待细胞充分裂解后，迅速加入等体积的2×十二烷基磺酸钠聚丙稀酰胺(sdspage)凝胶上样缓冲液〔100 mol/l trishcl(ph6.8)，200 mol/l dtt，4% sds，0.2%溴酚蓝，20%甘油〕，将样品置于沸水浴中加热5 min后，室温10 000 r/min离心10 min，将上清液用紫外法进行蛋白定量。取含30 μg总蛋白的细胞裂解产物进行12% sdspage电泳。停止电泳后，取出凝胶，于4℃ 100v条件下转膜1 h。然后用脱脂奶粉37℃封闭1 h，充分洗膜后加相应稀释的一抗溶液(磷酸化akt按1∶500稀释、gapdh按1∶2 000稀释)4℃过夜。充分洗膜后加入hrp酶标二抗(1∶2 000)，37℃与pvdf膜共孵育1 h，孵育结束后洗膜后将杂交膜与感光胶片安装好后于暗室内曝光，观察相应蛋白条带表达情况。用凝胶成像及分析系统分析蛋白显色的密度值，比较各组细胞akt/gapdh值。 　　1.3 统计学分析 　　采用spss16.0统计软件进行分析，实验数据以x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用最小显著差法(lsd)。 　　2 结 果 　　2.1 各组细胞增殖能力比较 　　mtt法检测结果表明，正常对照组a值为1.49±0.04，angⅱ组a值为1.18±0.06，明显高于正常对照组，差异有统计学意义(plt;0.05);除gbe低剂量组外，gbe高、中剂量组a值均明显高于angⅱ组，且差异有统计学意义(plt;0.05)。见表1。 　　2.2 各组细胞磷酸化akt表达量比较 　　tt及ol/l 的ang