食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法研究进展的论文.docVIP

　　食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法研究进展的论文 作者：刘书花魏云波林小静 李景超 　　摘要单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,广泛分布于 自然 界。针对目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测现状, 总结 了4种现行有效的常用检测方法,并对各种检测方法的优缺点进行了分析比较。实时荧光定量pcr检测技术,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,不需要凝胶电泳过程,避免了扩增产物对环境造成的污染问题,将是未来分析检测 发展 的一个主要趋势。 　　关键词单核细胞增生李斯特氏菌;传统检测方法;酶联免疫技术;分子生物学技术 　　单核细胞增生李斯特氏菌(listeie monocytogenes 简称l.m;单增李氏菌)是一种人畜共患病病原菌[1],使人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成怀孕妇女流产、死胎等疾病。近年来国外报道该菌所致的食物中毒越来越多,病死率高达30%~70%[2-3]。国内也不断有散发病例,引起了国内医学界的普遍关注。免疫学检测技术奠定了基础。单核增多李斯特氏菌的免疫学方法主要是elisa技术,具有操作简便、通量高的特点,可在同一时间内检测大量样品,并可将纯肉汤培养物中的分离物进行属水平的鉴定。但由于菌体及鞭毛抗原交叉反应的存在,还难以进行李斯特氏菌种间特异分析。同时,由于单核细胞增生李斯特氏菌表面抗原极其丰富,且大部分优势表位与属内外细菌有广泛的交叉抗原,给筛选特异性单克隆抗体带来一定的困难,增加了假阳性结果的几率。因此,用elisa方法从增菌培养物中筛选李斯特氏菌,一般还需要在选择性分离平板上划线培养,这同时也延长了检测周期。 　　3分子生物学方法 　　3.1传统pcr方法 　　目前,应用分子生物学技术检测单核细胞增生李斯特氏菌是一个不断探讨和深化的方向,国外已经开展了大量的研究工作。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)最早由mulhs和cetus公司的同事于1985年发明的,是一种通过在体外模拟自然dna复制过程快速扩增特定dna序列的方法。随着对单核细胞增生李斯特氏菌研究的不断深入,人们已经积累了大量有关单核细胞增生李斯特氏菌的资料,许多重要的致病因子如溶血素o、内化素、增溶血因子、磷脂酶、铁蛋白、热休克蛋白、过氧化氢酶及超氧化物歧化酶等已经分离提纯,其编码基因序列也已被克隆测序。bessesen mt等[11]于1990年建立了pcr检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法,通过扩增李斯特氏菌溶血素基因hlya中386 bp的pcr方法检测单核细胞增多性李斯特氏菌,dna检测量为25 ng,即1 000个菌体。姜永强等[12]在应用pcr方法对单增李斯特氏菌进行检定的基础上,作了如下改进:用微孔板杂交法检测单增李斯特氏菌溶血素(lister-mysino)编码基因hlya片段,使特异性和敏感性大大提高;通过化学抽提的方法制备模板,可较好地避免食物成分的抑制。 　　3.2实时荧光定量pcr检测技术 　　实时荧光定量pcr检测技术是在传统pcr检测技术的基础上发展起来的核酸定量技术,它通过在pcr反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的累积实时监测整个pcr进程,并根据检测ct值推断目的基因的初始量。1995年,bassler ha等[13]最早建立了用于单核细胞增生李斯特氏菌检测的荧光定量pcr体系,将荧光定量pcr技术应用于单核细胞增生李斯特氏菌检测,该体系以hlya基因为检测靶点,设计合成了相应的检测探针,检测灵敏度为50 cfu反应。徐德顺等[14]在常规pcr方法检测单增李斯特氏菌的基础上,利用特异性探针法自行设计与建立了实时荧光定量pcr检测方法,对40份食品样品中单增李斯特氏菌进行了检测,其灵敏度达到了只需19个细菌就可以得到阳性结果,且检测速度快,包括核酸提取在内整个检测时间仅为3 h左右,比传统细菌培养法和常规pcr法所需时间大大缩短,结果更为直观,灵敏度也更高。 　　另外,孙烯等[15]又建立了基于sybrgreen染料的单核细胞增多性李斯特氏菌的荧光定量pcr检测方法,并利用此方法检测人工污染的牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌菌量,结果表明检测灵敏度约为100 cfu反应。刘仲敏等[16]将单增李斯特氏菌实时荧光定量检测技术应用于批量样品的检测,从加样到结果只需要2 h左右,不但保留了常规检测的特异性和敏感性,还可同步完成多达96个样品的扩增及定量,适宜于大批样品的检测处理,极大地提高了检测时限,为食品污染的监测和食物中毒事件的快速反应提供了技术支持。 　　4结语 　　传统的分离培养鉴定方法,即gb/t4789.30-2010作为各种检测方法的基础,目前已经和