第五章 基因的重组与转移.ppt

;外源DNA;;一、粘性末端的连接;1. 两段DNA的连接;2. DNA片断与载体的连接;;;二、齐平末端（blunt end）的连接;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;;用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ; ;④缺点：;（3）DNA接头 (adapter)连接法;;;;;;三、PCR产物的连接;引物1;GCTAGCCGG ;带酶切位点的PCR产物;2. 与T载体直接连接;;四、DNA体外连接应注意的事项;EcoRI;2. DNA插入的方向正确;3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确;4. 防止载体自身环化连接;1. 载体自身环化连接（能存活）;;1. 目的;使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。;;用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。;4. 制备过程;二、重组DNA导入大肠杆菌;每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 ;10ng载体DNA;LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6;4. 平板培养基培养细菌;环形重组质粒 质粒自我连接;①生长状态;把重组的噬菌体?DNA或Cosmid???粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。;cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。;;;(5) 体外包装过程 ;体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每?g ?DNA能形成106噬菌斑）。 ;转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。;（1）利用原生质球进行转化 ; 酵母;叶盘;植物细胞;又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles);（1）原理：;不需要载体。;脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。;直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。;二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡萄糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。;;外源基因导入细胞的方法