牛奶DNA提取说明.doc

牛奶中细菌DNA提取试剂盒 Norgen生产的牛奶细菌DNA提取试剂盒的设计是为快速提取从牛奶中发现的多种细菌DNA基因组而准备的。这个试剂盒可供从牛奶样品中发现的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的DNA基因组。DNA基因组是优先于其他蛋白细胞质中纯化得到的。DNA基因组的标准产量依牛奶样品中细菌的密度和种类不同而不同。纯化的DNA基因组可以被已检测到的限制酶完全消解，并且完全兼容PCR，可以用PCR定量和Southern印迹法分析。 Norgen的提纯技术 纯化是使用Norgen所设计的树脂作为分离基质用旋转柱层层析法进行的。Norgen树脂在高盐浓度下结合DNA，在低盐和弱碱条件下释放已结合的DNA。在牛奶样品中发现的细菌的DNA基因组的提纯过程中的第一步离心牛奶样品以凝集可能存在的细菌。如果DNA是从革兰氏阳性菌或未知菌株中提取，那么凝集团块悬浮在酶切缓冲液中以供分解细菌细胞壁。下一步涉及到的溶解细菌细胞是与提供的裂解缓冲液和蛋白酶K结合，这适合各种细菌。在孵育45分钟后，将结合液和酒精加到裂解物中，并将溶液卡到核酸纯化柱上。Norgen树脂结合DNA的方式取决于离子浓度,因此,DNA将结合到纯化柱上,而大部分的RNA和消化蛋白质会倒掉或留在树脂上部。结合DNA再用提供的清洗缓冲液清洗两遍以除去所有残留杂质，用洗脱缓冲液洗脱纯化的细菌DNA基因组。 说明书 试剂盒说明书 最大牛奶量 1ml 10个样本的纯化时间 1小时 可处理细菌种类 革兰阴性菌和格兰阳性菌 最小可捡限量 每毫升牛奶10个细菌 优点 用快速核酸纯化柱快速又简便 可提纯牛奶中发现的格兰阳性菌和革兰阴性菌中的DNA基因组 可检测到并提纯牛奶样本中的极低浓度细菌（每毫升10个细菌） 提纯高质量DNA基因组 试剂盒组分 组成 每25个样酶切缓冲液3ml裂解液12ml结合液4ml洗液115ml洗液25ml洗脱缓冲液8ml蛋白K（冻干）6mg溶菌素（粉）60mg小型核酸纯化柱25收集管251.7ml的洗脱管25产品说明书1储存条件和产品的稳定性 所有液体严密密封，在室温下保存。溶菌素在到达前保存在零下20摄氏度，酶切缓冲液在添加溶菌素前保存在零下20摄氏度。冻干的蛋白K在到达前和复原后应该保存零下20摄氏度。这些试剂在未开封前可保质至少1年。 预防措施和免责声明 这个试剂盒是专门为科研设计的，并不为人类和诊断使用。 使用试剂时确保穿着合适的实验服、戴一次性手套、护目镜。有关更多信息，请参考合适的材料安全数据表（MSDSs)。这些可以在中看PDF文件。 结合缓冲液和清洗液1中含有胍盐，使用时要小心。胍盐再与漂洗剂结合时形成高活性化合物，因此必须妥善处理这些试剂。 提供试剂和设备 ·微型离心管 ·台式微量离心机 ·微量移液枪 ·550C孵化箱 ·370C孵化箱（只为革兰阳性菌） ·溶葡球菌酶（只可选革兰阴性菌） ·96-100%的酒精 ·棉签 使用之前的准备 1.会用到一台可用最大量程的变速离心机。如果没有可变速离心机，可以用一台固定转速的离心机，不过可见产量下降。 2.预热孵育箱或加热器到550C（未知或格兰阳性菌热到370C） 3.给提供的清洗液 = 2 \* ROMAN \* MERGEFORMAT II离心管中加入15ml96-100%的乙醇。这部完了将是20ml。瓶子上的标志以供检查是否加了乙醇。 4.将蛋白酶K溶于300μL分子水平级别的水，等分成小分，在零下20摄氏度下保存这种没用过的蛋白知道使用时。 5.将提供的酶切缓冲液加到含有溶菌酶的离心管中，混合均匀。等分成小分，在零下20摄氏度下保存这种没用过的蛋白直到使用时。 6.已知革兰氏阳性菌抗溶菌素，比如葡萄球菌，就该补充含溶葡球菌素的酶切缓冲液（不提供）。每管液体中，加5微升溶葡球菌素液到100微升的酶切缓冲液中（含溶菌素）。 7.如果只提革兰氏阴性菌，请用1A步骤；未知或革兰阳性菌，请用1B步骤。 1A 将最多1ml的牛奶加到微型离心管中。 注：最多1毫升的牛奶是推荐给正常的牛奶样品或亚临床乳腺炎样本。临床乳腺炎样本,尤其是那些高白细胞的样本,建议最多200μL牛奶样品。如果样品非常粘，非常难吸,用18ml规格的注射器细几次即可降低其粘度。 2.14000g离心3分钟 快速倒立管倒掉上清，并在废液池壁轻轻磕几下以确保磕掉离心后牛奶样品上层飘的奶油。用干净的2