DNA提取与-鉴定.pptVIP

;实验指导老师 刘晓颖 张萍萍 陈彦 王剑峰 李绍飞 2012-02;生物化学大实验;生物化学大实验;实验要求;成绩评定;动物组织ＤＮＡ的提取与鉴定;分离纯化核酸原则与要求;;DNA在细胞内的分布;;DNA的性质;真核生物基因组DNA分离纯化的基本步骤; 　高分子质量DNA在物理上仍是易碎的，在溶液中，长而弯曲的DNA分子随机卷曲，并因碱基堆积力和磷酸 基团间的静电排斥力变得粘滞，容易受到吸液、振荡、搅拌等引起的流体剪切力作用而断裂，因此，基因组DNA容易成片断获取，但所需分子质量越大，获得的难度也相应增加，大于150 kb的DNA分子在常规分离方法中多被切断。 去除蛋白质常用酚、氯仿抽提，反复抽提操作对DNA链机械剪切机会较多，因此有人使用80％甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可得小于200 kb的DNA片段。;猪脾脏DNA提取与鉴定;【实验原理】;　　核酸提取液中含有的蛋白质、多糖等可以用沉淀分离法除去。 　　在核酸提取液中加入氯仿-异戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿一水界面上形成凝胶状沉淀而离心除去，核酸仍留在水溶液中。;核酸都不溶于有机溶剂，可在核酸提取液中加入亲水有机溶剂（乙醇），使DNA或RNA呈絮状沉淀析出。;【实验材料】;【实验方法】;【实验方法】;8．加入l/2体积的氯仿-异戊醇溶液(24:l ,V/V) 40mL，上下剧烈振荡2-5min ，使组蛋白分离，于3500r/min，离心l5min，吸出上面含有DNA和DNP的水层，弃去两层间的变性蛋白凝胶，回收下层有机相。 9．上层水相再次加入20mL氯仿-异戊醇混合液，继续抽提去除蛋白，多次重复此操作（至少共3次）直至两相之间无明显变性蛋白质凝胶生成。;10．最后吸出上清液并将它连续注入两倍体积预冷至4℃的95％乙醇中。 11．用玻棒小心捞出纤维状DNA钠盐沉淀，沥干乙醇溶液后，依次用80％和95％乙醇洗涤，最后用少量无水乙醇洗涤，轻轻压挤沉淀，尽量吸尽乙醇后，铺开在表面皿上。置真空干燥器内干燥，即得白色纤维DNA钠盐。 ;【注意事项】;2．除去蛋白质时，若振荡剧烈可使部分DNA断裂，乙醇沉淀后，除能缠绕粘附在玻棒上的纤维状DNA外，溶液中还会有絮状沉淀，即为断裂的DNA。但若振荡不够，蛋白质不能很好除去，则影响DNA制品的质量。 3．细胞核沉淀加入浓盐溶液，冰箱放置过夜后，有时可能形成块状凝胶(如以脾脏为材料制备DNA)，应置捣碎机内绞5s，打碎凝胶块，但此时DNA已从核内溶解出来，因此不宜剧烈打碎。 ;思考题;;DNA的鉴定与分析;二苯胺显色法测定DNA含量（一）;; 1. DNA标准曲线的制定： 取14支试管，分成2组，依次加入0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mlDNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2ml。然后各加入4ml二苯胺试剂，混匀。于沸水浴中加热10min ，冷却后于595nm处进行比色测定。取两管平均值，以DNA浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。;; 2. 制品的测定： 取2支试管，各加2ml待测液（内含DNA应在标准曲线的范围之内）和4ml二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。 3.?根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量，计算出制品中的百分含量。 ; DNA纯度： 待测液中测得的核酸微克数 DNA%= × 100 待测液中制品的微克数 DNA产率: 测得的DNA的微克数 DNA%= × 100 原料的微克数 ;二苯胺试剂仅能与嘌呤核苷酸中的脱氧核糖反应. 因此测定的可靠性受到不同来源的DNA中嘌呤与嘧啶核苷酸比例变化的限制，为提高测定准确度，应使用经纯化的其含磷量已知的小牛胸腺DNA作为标准样品进行校正。;紫外吸收法测定DNA纯度（二） ;1．吸取2.5mlDNA样品，转入石英比色杯中(若样品很少，可用0.5mL的比色杯，上述体积均减一半)。 2．用2.5mL 0.01mol/L NaOH校正紫外分光光度计的零点。 3．在260nm，280nm处分别读出吸光度值(A)。 定量分析：DNA的浓度=A260×核