凝胶色谱柱.doc

装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。3、?柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。4、?上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。 .交联葡聚糖：葡聚糖凝胶颗粒的商品名，用于凝胶过滤，其大小不同颗粒可用于对各种不同原子量的物质进行分离，作分子筛色谱法介质 这是葡聚糖凝胶，G后面的数字代表凝胶颗粒的大小。具体操作详见，说明书啊 ！ 但是G-200的分离范围好像也不大啊，只有20万 Sephadex G-100 对多糖的分离范围最大直到10万，而多糖大于十万的多得是呢 只适用于水中应用，不同规格分离不同分子量范围的化合物。 sephadex g25 g25是什么意思？ 参考见解：Cross-linked dextran gel G-25,葡聚糖凝胶　G-25,白色珠状颗粒。一种由葡聚糖经醚键相互交联合成具有多孔性三度空间网状结构的高分子分离材料，为稳定的亲水性凝胶，G-10是表示G类凝胶吸水量的型号。可将G后的数字除以10即为该凝胶每克干重所吸水分的毫升数。能使一定分子量范围的大分子进入凝胶的网状结构内，不溶于水、盐 分离和提纯蛋白质、多糖、酶、核酸、 HYPERLINK /e/search/result/?searchid=3978 \t _blank 激素、 HYPERLINK /e/search/result/?searchid=3944 \t _blank 氨基酸、多酞和抗菌素等。 比较基础，适合新虫学习！ 一、装柱装柱子（添硅胶）时，常用的有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。不论干法还是湿法，硅胶（称为固定相更为广义）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm左右（长度没有绝对之说，根据自身情况而定，制备的大柱可以长达一米），太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压（土方法可以用养鱼的氧气泵加压或是用氮气，当然不加压也可以）用淋洗剂走柱子，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。 （我一般都用湿法装柱）干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧（湿法也要敲的，效果好点），至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实（一般柱子不敢用油泵抽，怕把柱子抽裂了）。接着是用淋洗剂走柱子，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于走柱子时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到）（梯度洗脱时，湿法装柱也会出现该情况，比较不好处理，可以缓慢改变溶剂，且置于通风处），容易产生气泡，