双缩脲法测定的蛋白质.ppt

生物化学与分子生物学实验;实验记录;实验室规则 ;实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。实验完毕，仪器洗净放好。 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。 严禁在实验室内吃饭、吸烟、扔废物和随地吐痰，实验室内学生轮流安排值日，实验结束离开实验室之前，关好窗户，切断电源，水源，确保安全。;试剂使用规则;吸量管的使用;吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹） 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中，以免污染吸量管及试剂。 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。 ;玻璃器皿的一般清洗方法 一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷后，用洗衣粉刷洗，再用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次。干燥备用。 容量分析仪器：吸量管、滴定管、容量瓶等，先用自来水冲洗，待晾干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，最后用蒸馏水淋洗2～3次，干燥备用。 比色杯：用毕立即用自来水反复冲洗。洗不净时，用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗。避免用碱液或强氧化剂清洗，切忌用试管刷或粗糙布(纸)擦拭。 上述所有玻璃器材洗净(以倒置后器壁不挂水珠为干净的标准)后，根据需要晾干或烘干。 ;分光光度法;Beer-Lambert定律－吸收光谱法基本定律;光吸收示意图;吸收光谱和物质的定性分析;不同浓度的VitB12溶液对相同波长的光的不同吸收;原理：根据物质对于入射光的特征吸收，可应用于物质溶液的定性检测 比较吸收光谱曲线：在相同的条件下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同。 比较最大吸收波长：不同物质的最大吸收波长不同；化学结构相似的物质最大吸收波长相同，吸收系数不同。 比较吸光度的比值：多用于检测物质的纯度（DNA A260/A280=1.8 纯度鉴定);物质的定量分析;分光光度计的基本构造;722分光光度计使用方法;722分光光度计使用注意事项;双缩脲法测定蛋白质含量;蛋白质在强碱性溶液中与稀硫酸铜溶液作用产生颜色反应，生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。 在一定的浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质含量呈线性关系。因此可用比色法测定蛋白质浓度。;紫红色铜双缩脲复合物分子结构;在分光光度法中，许多不吸收光的无色物质可以用显色反应变成有色物质，使之能进行比色测定，并能提高测定的灵敏度和选择性。在比色分析或分光光度分析中，将待测组分转变成有色化合物的反应叫做显色反应，与待测组分反应生成有色化合物的试剂叫显色剂。 在实际分析中，同一待测组分可与多种显色剂发生显色反应，生成不同的有色物质。为了保证测定的灵敏度和准确度，在分析时常需对显色反应进行选择，选择原则如下： 1. 选择性好，干扰少或干扰易消除； 2. 灵敏度要高； 3. 生成有色化合物的组成恒定，化学性质稳定； 4. 生成的有色化合物与显色剂之间的颜色须有明显的差别，最大吸收波长之差大于60nm。; 管号 试剂; ;读数时要注意读的是A的值； 注意正确标记试管（用记号笔清晰标记于试管2/3高处）； 准确记时。