XB209单纯疱疹病毒实验室检测讲述.doc

实验室　　　　主　题文件编号XGYYJ-6-XB-209东莞市谢岗人民医院 性病实验室单纯疱疹病毒实验室检测第  PAGE - 9 - 页 共  NUMPAGES 9 页第 1 版　 第 次修改颁布日期： 2012 年 1 月 1日 制 定 者 审 核 者 批 准 者黄金印 罗衬银 罗衬银2011年 12 月 1 日2012年 1 月 1 日 2012年 1 月 1 日  PAGE - 9 - 单纯疱疹病毒实验室检测 单纯疱疹病毒是引起生殖器溃疡的主要病原之一。HSV包括HSVI型和HSV2型，多数生殖器疱疹有HSV2型引起。生殖器疱呈慢性复发过程，原发感染常表现为潜伏状态，尽管临床可以根据典型的水泡诊断生殖器疱疹，但三分之二的感染表现为无症状，且潜伏期排毒。实验室诊断对于无症状感染具有重要意义，不仅防止性传播，而且防止母婴传播。 细胞学检查 [原理] IISV感染宿主细胞可形成多核巨细胞，细胞经涂片染色，通过检查多巨细胞病变帮助诊断。 [材料] 姖姆萨染液 巴氏染液 [方法] 1.标本采集： ①疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后棉拭子吸取疱液。 ②溃疡：用棉拭子抹去溃疡表面的痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液。 ③宫颈：见淋球菌取材。 2.将标本涂片，室温干燥数分钟。 3.染色 ①皮肤黏膜标本用甲不相酵固定5-10分钟，用姖姆萨染液染30分钟，待干、镜检。 ②宫颈标本用95%乙酵固定15-60分钟，用巴氏溧色（见HPV染色），镜检。 [结果] 感染细胞呈胞浆空泡变，感染细胞相互融合成多核巨细胞，有时见核内包涵体。 [注意事项] HSV感染细胞在水疱或溃疡基底处，尽可能取水疱标本。 [临床意义] 查到多核巨细胞或包涵体可作辅助性诊断。但其敏感性较培养法低。 HSV细胞培养 [原理] HSV在体外感染细胞，引起细胞病变，通过观察细胞病变初步判断病毒的进一步结合免疫学方法鉴定。 [材料] 1.Vero、Hela和BHK细胞等 2.标本运输培养基（配制见附录I）。 3.HSV生长培养基（配见附录I）。 4.HSV维持培养基（配见附录I）。 6.HSV荧光单克隆抗体试剂。 [方法] 2.标本采集： ①疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后，用棉拭子充分沾取疱液，洗入运输液中。 ②溃疡：用棉拭子去除溃疡表面的痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液，将标本洗入运输液中。 ③宫颈：见淋球菌取材。 标本置于运送培养基中，24小时接种，超过24小时应置于低温冰箱保存。 2.细胞复苏和传代：冻存细胞管于37℃速溶 内容物 内容物移至细胞生长培养基中 37℃5%CO2环境下培养8小时 更换生长培养基，再培养2-5天细胞成片 倒去培养液 加入5ml胰酶-EDTA洗涤 倒去洗涤液 加入5ml胰酶-EDTA液 培养瓶置于37℃，4分钟细胞脱落 转移至10ml生长培养基 加入10%DMSO 分装保存于超低温冰箱备用 3.单层细胞制备： 胰酶消化细胞混合液 计数 调整细胞数量为1X105/ml 分装24孔培养板，每孔0.5ml 37℃培养8小时 单层细胞 4.标本接种与感染细胞： 0.3-0.5ml标本 培养孔（1-2孔） 37℃，5%CO2下1-2小时 吸去标本液，换维持培养基。 37℃培养3-7日 每日观察[细胞病变（CPE）记录： 0为无CPE；1+为25%细胞CPE；2+为25-49%细胞CPE；3+为50-74%细胞CPE；4+为75%以上细胞CPE。] 荧光单抗染色 5.染色镜检： 直接免疫荧光法：感染细胞涂片用甲醇固定10分钟，淋洗。加荧光标记单抗隆抗体，37℃染色30分钟。封片后镜检。 [结果] 感染细胞阳性可见苹果绿色荧光的包涵体。 [注意事项] 1.棉拭和木杆含有对病毒有影响的物质，应将标本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。 2.使用阴道制剂的病人标本不宜作