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ds,金属,实验报告 RT-PCR实验报告 逆转录pcr rt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse transcription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr 中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。 由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转 录酶）来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成， 随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。 rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用 于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。（检测基因表达的方法，参见 northern blot法。） rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写 作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。 实时pcr实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量 为基础进行dna的定量分析。 real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。 一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序 列相结合的一种萤光探针（probe）。 real time pcr 与 reverse transcription pcr 相 结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rt pcr 的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）” rt-pcr技术相关试剂 oligo: 多聚体，相当于mrna引物 amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸 rnase：rna酶抑制剂 pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子 pcr各步骤的目的 （一）预变性： 破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。 使dna充分变性，减少dna 复杂结构对 扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要 吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr 反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环：①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr 扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右， 引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料， 靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复 制链。 （三）pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使 用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min， 依次照推。通常在最后一轮要适当的将 延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用 是：在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用，可以直接用于ta克隆的进行。什么是半定量pcr 半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction ,sqrt-pcr）是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方 法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中 特异mrna的相对数量。以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标