分子医学实验报告(共7篇).doc

分子医学实验报告(共7篇) 医学分子生物学实验报告 医学分子生物学实验报告 日期：2012-04-14 医学分子生物学实验报告 一、实验名称： 1、质粒的提取 2、质粒DNA的限制性内切酶酶切 3、DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验目的： 1、掌握碱裂解法分离质粒DNA的基本原理和操作要点 2、了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 3、学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 三、实验原理： 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子，具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染色 体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定 遗传的遗传因子。 碱裂解法利用宿主菌巨大线状染色体DNA与相对较小的闭环双链质粒DNA的结构的差异 来提取质粒DNA。碱变性DNA时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然 状态而不能彼此分开。当去除变性条件时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全 天然超螺旋状分子，而难于复性的长链线状的基因组DNA则与破裂的细胞壁、细菌蛋白相互 缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当K+取代Na+时这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细 胞碎片上一起被离心除去。 质粒检测：(1)电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型 三种构型；（2）吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值 260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有 蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA 同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切 酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质 粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应 数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用的EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶 切位点分别为 和 TTCGAA DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，把这些核酸分 子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小，可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。 四、实验步骤： (一)质粒的提取：? 1、取2.0mL菌液（老师已配好）加入2.0ml的dorf管中； 2、将dorf管放进离心机用5000 r/min、离心5min，弃上清，收集菌体； 3、加入200uL溶液I+5uLRNA酶悬浮菌体（充分混匀），冰上静置5min ； 4、加入400uL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min让裂解菌体； 5、加入300uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min使质粒DNA复性； 6、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min，取700μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管； 7、加700μL的 氯仿：异戊醇［V:V＝24:1］（混匀），冰上静置5min； 8、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min，取500μL（注不要吸到沉淀物）上清到一新管； 9、加入1.0mL无水乙醇（充分混匀），在-20℃条件下放置20min； 10、在4℃条件下，10000 r/min，离心10min ，弃上清； 11、向沉淀物中加入500μL70%乙醇，将沉淀悬起； 12、在4℃条件下，5000 r/min离心5min，弃上清（用软纸将管内乙醇吸干）即可。 （二）酶切： 取实验一中提取的质粒，向其中加入10μL灭菌的双蒸水使其充分溶解，测定其dsDNA浓度。然后按下表进行操作： 充分混匀后于37℃保温2-3h。（注最终反应体系中质粒浓度至少达到1.2μg/μL） 由测量数据计算得：X=7 （三）DNA的琼脂糖凝胶电泳: 1、制胶 —— 1.0 ％琼脂糖凝胶 (50ml)（老师已制好） 2、凝胶板的制备 ——用微量加样器小