第5章分子生物学法(上)总汇.ppt

第5章 分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术;第5章 分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.1 重组DNA技术史话 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 基因克隆技术 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术;从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，强调外源核酸在另一种寄主细胞中的繁衍与性状表达。;5.1 重组DNA技术史话;但当时缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，而无法对这类物质进行直接的生化分析。 随着DNA分子体外切割与连接及核苷酸序列分析技术的进步，推动了重组DNA技术的产生与发展。 重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。 工具酶的发现与应用是现代生物工程技术发展史上的重要事件(见P167表5-1)。 将外源DNA和载体分子重组成杂种DNA分子后，还必须通过转化过程将其导入到新寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖。;6;7;5.2 DNA基本操作技术;核酸凝胶电泳的基本原理： 某种分子在特定的电场中，就会以一定的速度向适当的电极移动。 某物质在电场作用下的迁移速度称为迁移率。 迁移率与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。 生理条件下，核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。把核酸分子放置在电场当中，将会向电场的正极方向迁移。 普通凝胶电泳只能进行DNA小片段分离，应用脉冲电场凝胶技术可进行超大DNA片段的分离研究。;称样;取样;12;5.2.2 细菌转化;5.2.3 聚合酶链式反应技术;PCR扩增原理;5.2.4 实时定量PCR;5.2.5 重亚硫酸盐测序技术;甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤，真核生物主要发生于胞嘧啶。 DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，而参与调控许多重要的生物学现象和发育过程。 DNA甲基化将会抑制基因表达。 DNA的CpG序列在动物基因组的某些区域密度比较高，形成CpG岛。 哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛， CpG岛常位于基因启动子区或第一个外显子区，只有CpG岛中的胞嘧啶能被甲基化。 肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中则呈高甲基化状态。;实验中常用重亚硫酸盐测序法来确定某个碱基位点的甲基化情况，其主要过程(见P182图5-15)： 将待测DNA样品用限制性内切核酸酶处理，或用超声波破碎成500~1000bp的碎片。 重亚硫酸盐处理使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)发生脱氨基作用转变成尿嘧啶(U)，甲基化后的胞嘧啶不受影响。 PCR扩增后的尿嘧啶(U)被测序仪读取为胸腺嘧啶(T)。对引物的选择和设计要求非常高。 参考原始序列即可判断原C位点是否甲基化，未甲基化的C经处理后成T，甲基化的C不变。;5.2.6 基因组DNA文库的构建;21;5.3 RNA基本操作技术;将组织在液氮中磨碎，每50~100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。 将匀浆样品在室温(15~30℃)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置3分钟。 2~8℃10000×g离心15分钟。样品分三层：底层为黄色有机相， RNA在上层水相中和一个中间层。 水相转移到新管中，每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇(沉淀水相中的RNA)，室温放置10分钟。 2~8℃10000×g离心10分钟，离心后在管侧和管底出现胶状RNA沉淀，弃上清。 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每1ml TRIzol加1ml 75%乙醇。2~8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀。;5.3.2 mRNA的纯化;5.3.3 cDNA的合成;26;5.3.4 cDNA文库的构建;5.3.5 基因文库的筛选;5.4 基因克隆技术;5.4.1 RACE技术;5?RACE 在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部特异性引物(GPS1)启始cDNA第一条链的