HER2在结直肠癌中的表达及意义.docVIP

　　HER2在结直肠癌中的表达及意义 作者：张凯 王中义 李春生 李红 刘铜军 【摘要】 　　目的 研究HER2在结直肠癌的表达及意义。方法 应用pathin内迅速置于干冰上，而后再转入-70℃冰箱中进行低温保存。 　　1.1.2 抗体 　　106种抗体均购于Sigma及Cellsignal公司。pPKCα (Ser657)/pEGFR (Tyr1068)，pHER2/ErbB2 (Tyr1221/1222)/pPDK1 (Ser241)，pPKC α/βⅡ (Thr638/641)/pp53 (Ser392)，pAKT (Ser473)/pPTEN (Ser380)，pRB (Ser780)/pSurvivin，pbetacatenin(Ser33/37/Thr41)/pstat5(Tyr694)，pStat3 (Ser727)/pERK，Thr202/Tyr204)(P44/42)pcKit (Tyr719)/pEGFR (Tyr1148)，pp70 S6 Kinase (Thr389)/pVEGFR Receptor 2 (Tyr951)pFGFR (Tyr653/654)/pEiF4B (Ser422)，pHGF R，cMET (Y1234/Y1235)/pSmad (Ser463/465)pERK5 (Thr218/Tyr220)/pp90RSK (Ser380)，pHGF R/cMET (Y1003)/pCREB (Ser133)，pmTor (Ser2448)/pPKCδ (Thr505)，pIKB (Ser32)/pIGF1 R / Insulin R (Tyr1131/Tyr1146)，pcdc2 (Tyr15)/pcJun (Ser73)，pRb (Ser807/811)/pSAPK/JNK (Thr183/Tyr185)，pFLT3(Tyr 591)/pp38 (Thr180/Tyr182)，ProtEIn marker (Invitrogen)+IgG (25ng)cyclin B1/cyclin D1，Cdk6/cdc25B，cyclin E/cdk2，p27/BRCA1，Cdk4/Neu，1433 Beta/cPKCαERK/EGFR，DM2/cdc2 p34，E2F1/PA，cmyc/FGFR3 (B9)Notch 1/betacatenin，Akt/Trap，×IAP/Bcl2，ETS1/HIF1α，HIF2α/TTF1，p53/Notch4 (L5C5)PTEN/SRC1，p300/ckit，Ba×/Ncadherin，raf1/PA，cdc42/Eif4b，βactin/betatubulin/GAPDH， TNFα/Vimentin，OPN/Survivin，Ecadherin/TGFβ，p16/p27，esothelin，Cleaved Caspase3/CO×2，CREB/ATF1，p21/NFkB52，NFkB50/Calretinin，VEGFR2/p14，HRas/Bcl6，KRas/alphatubulin ，NFkBp65/Myf6。 　　1.2 方法 　　1.2.1 组织标本总蛋白提取、定量 　　（1）结直肠癌组织标本从液氮中取出后，迅速放置于锡箔纸包被的干冰上，使其保持低温状态防止蛋白的降解。利用取材管穿取约3 mm×3 mm×5 mm大小的组织块，加入1ml 蛋白裂解液于冰上用匀浆器研磨1 min，裂解10 min。（2）组织匀浆液转移至EP管。于超声水浴器中超声震荡3次，每次15 s。然后将样品置入4℃离心机（RCF：14 000 r/min）离心30 min；取上清即为提取总蛋白；（3）蛋白定量采用BCA法测定，样品放入37℃孵育30 min；（4）取出样品用分光光度仪在560 nm测定蛋白浓度，每个样品浓度取平均值。(5)然后将其浓度都稀释至2.5 μg/μl，加入1/3体积4×缓冲液，煮沸5min，置于-70℃冰箱保存。 　　1.2.2 pathin，吸取186.7 μl，加入已制备好的10% SDSPAGE胶顶层的合成胶，均匀横铺整个合成胶。(2)电泳：横压100 V，电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部。（3）转膜：卸下分离胶，将硝化纤维素膜(BioRad)、电转专用滤纸和海绵在电转缓冲液中浸泡平衡。电转时，从负极到正极依次是：海绵滤纸胶 硝化纤维素膜滤纸海绵，分别排除气泡，加入电转缓冲液，接通电源，恒压100 V 2 h。（4）封闭：电转结束后，取出硝化纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭40 min。（5）杂