ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定.docVIP

　　ROCKⅡ基因shRNA质粒表达载体的构建与鉴定 作者：李晓江 白云深 杨有庚 【摘要】 目的 构建表达Rho激酶(ROCK)Ⅱ特异性siRNA的重组质粒。方法 按照Elbashir等设计原则和siRNA表达载体的要求，利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件，设计带有BamH I、Bbs I酶切黏性末端、终止识别序列和LOOP环的shRNA，并将其克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒，然后进行酶切鉴定及基因测序。结果 设计的shRNA成功克隆入载体pGPU6/GFP/Neo，构建成ROCKⅡ特异siRNA重组质粒，酶切鉴定及基因测序表明设计序列完全相符，目的基因序列准确无误。结论 重组质粒构建成功，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供了一种有效的方法。 【关键词】 载体构建;RNA干扰;ROCK(Rho激酶) 　　RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。将与靶基因转录产物mRNA存在???源互补序列的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，生成的小干扰RNA(siRNA)与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导的沉默复合物，具有序列特异性核酸内切酶活性，能特异性降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。本研究采用含H1启动子的载体pGPU6/GFP/Neo，针对ras基因超家族中Rho激酶(ROCK)基因的短发夹结构RNA(shRNA)构建靶向ROCKⅡ特异性shRNA真核表达载体，为今后体外或体内研究ROCK基因在脊髓损伤后的功能修复提供一种有效方法。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料、试剂与仪器 生化培养箱、震荡培养箱(金坛仪器厂)，荧光显微镜(OLYMPUS公司)。连接试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)，限制性内切酶(TaKaRa公司)。 　　1.2 shRNA序列设计及合成 根据pGPU6/GFP/Neo中H1启动子启动表达siRNA对序列的要求,利用Ambion公司在线siRNA Tatget finder软件、.设计合成4条针对大鼠ROCK序列的siRNA DNA片段，分析获得的序列，选择GC含量在40% ～55% 之间的靶基因序列作为潜在优选，并在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，将选定的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除和其他编码序列同源的序列，以确定其为特异性序列。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，将包含目的siRNA序列的DNA设计为用DNA聚合酶合成的(PCR策略分别设计)包含目的基因siRNA序列的正义链和反义链寡核苷酸序列，在正义链和反义链序列加入间隔序列TTCAAGAGA，以避免形成终止信号，使其能形成发夹结构，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5′端添加了CACC，与Bbs I酶切后形成的黏端互补;反义链模板的5′端添加了GATC，与BamH I酶切后形成的黏端互补;如果siRNA的第1个碱基不是G，则在CACC后补加1个G。随机选取排列序列作为无干扰效果对照序列。编码siRNA的DNA序列由上海生工合成。4条寡核苷酸链及反义链见表1。表1 设计、合成的4对ROCK特异性siRNA位点、寡核苷酸链序列及GC含量 　　1.3 shRNA模板的退火 将DNA oligo分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100 μmol/L。取相应的正义链和反义链oligo溶液，按照如下配比配置退火反应体系：10×shDNA退火缓冲液5 μl，正义链(100 μmol/L) 5 μl，反义链(100 μmol/L) 5 μl，ddH2O 35 μl，总体积50 μl。在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃ 5 min，85℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，4℃保存。退火处理后得到浓度为10 μmol/L的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20 nmol/L，用于连接反应。 　　1.4 pGPU6/GFP/Neo载体的线性化 取2 μg pGPU6/GFP/Neo载体，按照如下体系进行酶切处理：10×缓冲液G 5 μl，Bbs I 2 μl，BamH I 2 μl，pGPU6/GFP/Neo 2 μg，ddH2O 41 μl，总体积50 μl。37℃酶切1 h，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 (TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50 ng/μl。 　　1.5 pGPU6/GFP/NeoshRNA载体的构建 按照如下体系进行载体的连接反应：10