Wnt3基因在急性髓系白血病中的表达及意义.docVIP

　　Wnt3基因在急性髓系白血病中的表达及意义 作者：李胜利，徐开林，李振宇，潘秀英，曾令宇 【摘要】 目的 研究L）患者中的表达及其意义。方法 应用实时定量PCR（real-time PCR）方法检测10名正常人、40例AML患者中L患者中的表达水平增高，AML缓解后L患者年龄、性别以及初诊白细胞数等临床特征无关；L发病中可能起重要作用，可作为判断AML预后的一个指标。 【关键词】 急性髓系白血病；L) patients. Methods Expression of L patients. Results The expression of L patients. The plete remission (CR) rate in AML patients ay play an important role in AML pathogenesis and can serve as an index in monitoring AML prognosis. Key yeloid leukemia; L）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者以及乳腺癌﹑卵巢癌细胞株中表达增加。本实验采用实时定量PCR（real-time PCR）方法检测L患者中的表达，并分析其意义。 1 资料和方法 1.1 研究对象 1.1.1 实验组 2007年6月—2008年6月徐州医学院附属 医院 血液科住院和门诊AML患者40例（初诊30例，复发10例）。其中M2 15例，M3 6例，M4 8例，M5 11例。男20例，女20例，中位年龄36（11～76）岁。10例初诊AML患者随访其缓解前后骨髓，随访中位时间1(0.5～3)个月。所有患者经过骨髓细胞形态学、组织化学染色、免疫表型、分子生物学、细胞遗传学等检查确诊。完全缓解（CR）指临床、血象及骨髓细胞学缓解，未缓解指部分缓解（PR）和未缓解(NR)。 1.1.2 正常对照组 10名，男4名，女6名，中位年龄32（24～48）岁，均为缺铁性贫血患者和造血干细胞移植供者。 1.2 主要试剂、仪器 Trizol抽提试剂盒（BBI公司）、AMV逆转录酶试剂盒（TOYOBA公司）、Taq DNA聚合酶试剂盒（纽英伦生物技术有限公司）、dNTPs(SANGON公司)、DAN Ladder(MBI公司)、SYBR Premic Ex Taq试剂盒（TOYOBA公司）、DEPC（AMRESCO公司）、PE-2400 PCR基因扩增仪（ABI公司）、Real-time 7500荧光定量PCR仪（ABI公司）。 NC）的分离 无菌条件下抽取骨髓2 ml，肝素抗凝，用等体积的Ficoll淋巴细胞分离液，分离出MNC，用1×PBS洗涤2次，取5×107个细胞，-80℃冻存备用。 1.3.2 总RNA的提取 细胞总RNA由Trizol抽提试剂盒提取，按Trizol抽提试剂盒说明书进行，所提总RNA经分光光度计测定光密度（D），D260/D280值在1.8～2.0者用于real-time PCR检测。 1.3.3 cDNA第一链的合成 20 μl反应体系包括：5×RT Buffer 4 μl,2.5 mmol/L dNDP 2 μl,Oligo(dT)18 1 μl,RNA Simple 3 μl,AMV逆转录酶2 μl，补无核酶水至20 μl。反应条件为30℃ 10 min,42℃ 60 min,99℃ 5 min灭活逆转录酶。cDNA于-20℃保存。 1.3.4 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板 选择表达mol/L dNTP 2.5 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,Taq DNA聚合酶1 U,上下游引物各1 μl,cDNA 1 μl,加水至总体积25 μl。采用的循环参数为:95℃预变性 5 min,35个PCR循环（94℃，30 s；退火温度，20 s；72℃，30 s）, 72℃延伸5 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物为单一特异性扩增条带；同样的方法获得GAPDH的扩增条带（图1）。将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为108，分别稀释为1×108、1×107、1×106、1×105这几个梯度浓度的DNA。 1.3.5 进行real-time PCR反应 50 μl real-time PCR反应体系包括:SYBR Premix Ex Taq 25 μl,上下游引物各1 μl,cDNA或DNA 1 μl,补水至总体积为50 μl。GAPDH：95℃，10 s；40个PCR循环（95℃，3 s；60℃，20 s；72℃，36 s）；溶解曲线（95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s）。e PCR反应。根据绘