带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达.docVIP

　　带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达 【摘要】目的:构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体,并在SicrobixBiosystems公司；pDC313穿梭载体；含有启动子和绝缘子的pBInshCMV质粒均为东方肝胆外科 医院 病毒基因治疗实验室保存；萤火虫荧光素酶质粒pGL3Basic购自Promega公司；含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子两个组件的质粒pRS由西班牙Navarra大学医学院钱程教授惠赠.各种限制性内切酶购自Neega公司；真核细胞转染试剂lipofectamine2000购自Invetrogen公司；胎牛血清、小牛血清购于GibcoBRL公司，胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒、病毒DNA提取试剂盒均购于QIAGEN公司.LB9506型Luminometer(Berthold公司)；PCR仪(德国BIOMETRA公司)；Napc05420二氧化碳孵箱(法国JOAVN公司)；6孔板(丹麦NUNC公司).PCR引物设计采用OLIGO 分析 软件在 计算 机上进行,正义引物和反义引物的5′端均设计有酶切位点,且其外侧设有保护性碱基.萤火虫荧光素酶（LUC）基因鉴定引物序列如下：正义引物5′CGCATGCCAGAGATCCTATTT3′，反义引物5′CGGGAGCCACCTGATAGC3′，引物由Invetrogen公司合成. 　　1.2方法 　　1.2.1穿梭质粒构建与鉴定利用分子生物学技术，将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子，以及RU486调控系统构建成单一的质粒载体PDC－RULUC，为减少两个转录单元之间的潜在干扰，加入了1600bp的绝缘子.载体构建流程如下：①pBInsluc用NhEi和KpnI切下的Insluc片段,插入pRS17质粒的NhEI和KpnI位点,重组质粒命名为pRSRULUC.②NotⅠ单酶切下pRSRULUC中的调控表达框和LUC基因表达框部分装入pDC312载体的NotⅠ位点中，构建成穿梭质粒pDCRULUC.通过PCR和限制性内切酶及测序，筛选阳性重组子. 　　1.2.2重组腺病毒的制备与鉴定重组腺病毒载体AdRULUC的构建采用AdMax腺病毒载体包装系统.将穿梭质粒pDCRULUC与以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3cre，通过lipofectamine2000试剂共转染至293细胞，通过Cre/loxP重组酶介导下的位点特异性重组，使共转染到293细胞中的穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒.操作方法如下：在6孔培养板中每孔接种3×105个HEK293细胞，将带目的基因的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架质粒各2μg，用lipofectamine2000试剂20μL共转染HEK293细胞，隔2～3d换液1次，约7～10d细胞出现病变，在显微镜下可见细胞变圆、脱落，这表明质粒在HEK293细胞中发生了同源重组.经过3次病毒空斑纯化，即得到携带LUC基因的可调控重组腺病毒.得到的重组载体用LUC基因的引物行PCR鉴定，以PGL3lucbasic作阳性对照，并设空白阴性对照. 　　1.2.3重组腺病毒载体的扩增纯化及滴度测定（TCID50法）重复感染293细胞，进行少量扩增，待全部细胞出现明显的CPE（48h后），收集上清及沉淀混合液，于-80℃～37℃反复冻融3次，破碎细胞，离心，取病毒上清再次感染293细胞，进行大量扩增，48h后收集沉淀，加入AdBuffer,以CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒2次.病毒滴度的检测以293细胞为靶细胞（1×108/L）,病毒液从1×10-4开始到1×10-11，行10倍连续稀释后分别感染293细胞，每一稀释度设10个复孔，阴性对照孔加含血清20mL/L的DMEM培养液2mL，10d后观察细胞病理反应（CPE），仅有小块或一些细胞出现CPE，该孔计数为阳性.病毒的稀释度以最低稀释度能感染所有293细胞、最高稀释度完全不能感染293细胞为宜.根据TCID50法计算公式，算出病毒的滴度. 　　1.2.4重组可调控腺病毒载体的表达用携带萤火虫荧光素酶报告基因可调控重组腺病毒感染结肠癌细胞株SOI=100感染细胞后继续培养细胞24h，分成七个处理组，各组加入一定量的RU486，使培养液的药物浓度分别达到0，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，1×10-10mol/L，每组均设复孔.继续孵育48h后行荧光索酶检测，而复孔组实验细胞则予更换新的RPMI1640培养液后继续孵育48h后检测荧光索酶活性. 　　1.2.5荧光素酶表达的检测采用