Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响.docVIP

　　Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响 作者：李桢林 江维 王永红* 郝玉有 储炬 庄英萍 张嗣良 【摘要】 在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响，证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸，发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异，而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快，达到1.0g/(L·h)，胞内丙酮酸积累，丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%，柠檬酸合成酶活性降低41%，发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象，最终效价比对照高出45.3%，而总异戊酰组分则降低了23%，其他酰化组分降低了39.6%；添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%，柠檬酸合成酶活性降低了47%，发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%，而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大，异戊酸在胞外积累，随后被重新吸收利用，最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%，效价和对照基本一致。 【关键词】 必特螺旋霉素； 缬氨酸； 亮氨酸； 异亮氨酸； 有机酸； 铵离子 ABSTRACT This paper demonstrated that supplementing valine (L-Val), isoleucine (L-Ile) and leucine (L-Leu) in synthetic media had different effects on biosynthesis of multi-ponents of biotechspiramycin. The results shoent of 0.05g/100ml amino acids after 36h of fermentation resulted in different pH values and ammonium ion concentrations of fermentation broth, and 2 to 3 time-increase of the activity of valine dehydrogenase. gSO4 0.55，NaCl 1.0，CaCO3 0.5。 (3)培养条件 将1ml甘油管接种于一级摇瓶，28℃培养48～56h，按10%接种量接种于二级种子摇瓶中，28℃培养24～26h，按8%接种量接种于发酵摇瓶(装液量50ml/500ml)中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。每天定时取样测定各种发酵代谢参数，测定结果为3个样的平均值。 (4)氨基酸添加方式 称取一定重量的Val、Leu和Ile在紫外灯下照射12h，并于发酵进行到36h时分别在不同的摇瓶中添加0.05g/100ml的Val、Ile、Leu。 1.2 试剂和仪器 乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸和异戊酸均为分析纯；Val、Leu、Ile、牛血清白蛋白为生化试剂；色谱仪为Agilent HP 1100(检测器：G1314A紫外可见波长检测器；进样器：G1328A)；酶标仪为Thermo MK3(Electron Corporation)。 1.3 测定方法 (1)生物量测量 采用测量菌丝干重法(Dry cell l发酵液，过滤后用蒸馏水洗菌体，连同滤纸于80℃烘至恒重后称量。 (2)总糖、还原糖测定 采用斐林试剂法［9］。 (3)铵离子浓度测量 采用Berthelot比色法［10］。 (4)以杯碟法［8］测生物效价，乙酰螺旋霉素为标准品，枯草芽孢杆菌作为鉴定菌。 (5)产物组分以及胞外有机酸测定。 HPLC法测定有机酸 乙酸、丙酸、丙酮酸和α-酮戊二酸 色谱柱：AquaSep(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(98.5∶1.5)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。 丁酸和异戊酸 色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(60∶40)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。 HPLC分析发酵样品 取必特螺旋霉素发酵液于3000r/min离心10min