三生饮对局灶性脑缺血大鼠海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响.docVIP

　　三生饮对局灶性脑缺血大鼠海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响 作者：王长松,王媛媛,晋光荣 [摘要]目的：探讨三生饮对大鼠局灶性脑缺血后海马区细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax蛋白表达的 影响 。 方法 ：用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，用SP免疫组织化学方法，检测再灌注后3、6、12、24 h及3 d不同时段海马区Bcl2和Bax免疫反应阳性细胞平均计数，统计 分析 三生饮 治疗 组和模型组的表达量。结果：两组海马区神经元均大量表达Bax蛋白，两组间无统计学差异；与模型组相比，三生饮治疗组大鼠缺血侧海马区Bcl2蛋白表达增多，表达时程延长（Plt;0.05）；在缺血侧海马不同区域，Bcl2/Bax之值不同。结论：大鼠脑缺血再灌注后海马区神经元均有Bcl2和Bax蛋白的表达，而灌给三生饮可促进海马区Bcl2阳性细胞的表达，提高Bcl2/Bax值；但三生饮治疗组大鼠海马区脑细胞仍然过度表达Bax阳性蛋白，最终发生凋亡。 [关键词]三生饮；脑缺血；海马；Bcl2蛋白；Bax蛋白；大鼠 三生饮是治疗卒中的代表方剂。以往的 研究 表明，该方可以缩小脑缺血大鼠的梗死体积，在局灶性脑缺血再灌注损伤中，可增加缺血侧大脑皮质Bcl2的表达，延长表达时程，提高Bcl2/Bax之值，减少脑缺血后的细胞凋亡[1]。本实验拟进一步观察该方对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后海马区Bcl2和Bax蛋白表达的影响，以期为揭示三生饮的作用机理提供实验依据。 1 材料与方法 1．1 动物健康成年SD（Sprague Dam，记录结扎时间，1.5 h后拔出尼龙线10 mm行再灌注；假手术组插入深度小于9 mm。 1．5 分组及给药造模后参照Longa 5分制评分标准评定，剔除0分及4分大鼠。将造模成功的大鼠随机分为模型组和三生饮治疗组（简称治疗组）各30只；分别在缺血再灌注后3、6、12、24 h及3 d 5个时间点处死大鼠，每个时间点6只。另设正常对照组（简称正常组）3只，假手术组6只。给药：术前1 d开始灌胃给药，每12 h 1次。其中，治疗组灌给浓度为1 g#12539;ml-1的三生饮煎剂，每次2 ml，其它各组灌给蒸馏水每次2 ml。 1．6 取材与切片用0.4%戊巴比妥钠过量麻醉大鼠，开胸腔经心灌注固定后取脑，后固定2 h，置30%蔗糖磷酸缓冲液中4 ℃过夜沉底；自视交叉后2 mm处，切取厚为2 mm的脑组织块，置LEica冰冻切片机切片，片厚7~8 μm，隔5张取1张贴片，-20 ℃冰箱保存。 1．7 Bcl2、Bax免疫组化检测取出冰冻切片，室温融化，磷酸盐缓冲溶液(PBS）冲洗5 min×3次，分别滴加0.3%双氧水(H2O2）10 min、羊血清封闭液（1∶10）15 min，一抗（1∶100），4 ℃冰箱过夜。生物素标记羊抗兔IgG（1∶300），37 ℃恒温箱30 min，辣根酶标记链霉卵白素（1∶300），37 ℃恒温箱30 min。以上各步骤均以0.01 mol#12539;L-1PBS（pH 7.2~7.4）冲洗3 min×3次，DAB显色，镜下控制反应时间，终止反应；苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察。对照试验用PBS代替一抗，余同上，结果阴性。 1．8 统计学处理每张切片随机采集6个具有代表性的高倍视野，采用网格计数法计数阳性细胞。结果用SPSS统计软件包进行统计分析，两样本比较采用方差分析和t检验，Plt;0.05表示有显著性差异。 2 结 果 2．1 海马区神经元在脑缺血再灌注后不同时间Bcl2的表达正常组与假手术组均未见Bcl2阳性细胞表达，而治疗组和模型组海马区Bcl2阳性细胞在再灌注后3、6 h均有表达，表达量无显著性差异；随时间延长两组均有不同程度增加，至再灌注后12 h模型组Bcl2阳性细胞达峰值，而治疗组于再灌注后24 h表达数最多，之后呈减少趋势；再灌注后3 d，治疗组Bcl2阳性细胞表达量较多，与模型组比较有统计学差异（Plt;0.05）。见表1。2．2 海马区神经元在脑缺血再灌注后不同时间Bax的表达正常组和假手术组海马区均未见Bax阳性细胞表达，而治疗组和模型组在再灌注3、6、12 h，海马区Bax阳性细胞表达随时间增加而增多，至24 h呈峰值，两组表达数量无显著性差异；再灌注24 h后Bax阳性细胞减少，两组比较也无显著性差异。见表1。表1 脑缺血再灌注后不同时间海马区Bcl2、Bax的表达 　　3 讨 论 　　脑缺血属中医“中风”范畴，急性期以风痰血瘀为主要病理因素，而“毒损脑络”是其重要的病理机制[3]，辨证选用中药可取得良好效果。然而，长期以来，由于畏惧药物的毒性，许多疗效独特的中药方剂被束之高阁。实际上，有毒中草药有其毒性的一面，也