中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法.docVIP

　　中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法 【摘要】 　　基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴定提供了可能。而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定技术开发的关健。文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研究进展 总结 了几种适合中草药特异性探针筛选的方法。 【关键词】 基因芯片； 中草药鉴别； 种特异； DNA探针 　　Abstract:DNA chip technology makes it feasible to identify Chinese herbal medicine rapidly, efficiently and in parallel. The screening of species-specific DNA probes from medicinal plants is the key step in developing DNA chip for the authentication of Chinese herbal medicines. bined e methods available for the screening of medicinal plants species-specific DNA probes marized in this paper. 　　Key edicine; Species-specific DNA Probe 在中药材基因鉴别和特征性基因测序的基础上，建立以基因诊断和基因芯片为载体的中药材分子鉴别技术和方法是今后中药生物技术研究中的努力方向之一［1］。中药鉴定的基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段，将中药种特异性DNA探针固定在玻璃片、尼龙膜或其它支持物表面上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG标记待检中药基因组DNA样本杂交，通过检测杂交信号来实现对中药的准确、并行、高效地检测。虽然DNA芯片技术已广泛应用于DNA测序［2］、单核苷酸多态性分析［3］、基因表达分析［4］、基因诊断［5］、药物筛选［6］、微生物种类鉴定等［7］各个方面，但应用于中药鉴定尚处于起步阶段，近年来随着基因芯片技术的广泛应用，国内外一些研究机构已开始研究使用基因芯片对中药(材)进行鉴别［8，9］。采用基因芯片技术鉴定中药的基本过程是［10］：①应用分子生物学技术找出待鉴定中药的特定寡核苷酸序列；②以此寡核苷酸序列作为探针，装配到芯片上；③检测样品（DNA）的提取、扩增和标记；④杂交检测及结果分析。其中找出待定中药的特定DNA序列（DNA探针）是建立中草药鉴定基因芯片的关键。本文结合近年来中药及其它物种鉴别芯片研究进展总结了几种可用于中草药特异性DNA片段筛选的方法，并对这些方法的优势和不足做出评价。 　　1 利用现有药用植物基因资源筛选其特异性片段 首先，登录GeneBank网站，在核酸数据库中检索研究对象及其相关种属的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微卫星序列或某种功能基因)，应用分析软件（如MacVector 6.5.1软件包中的Clustal .R. Bullen［15］从梯牧草属(Phleum)两个野生种P. alpinum和P. bertolonii的DNA文库中分别筛选到它们的特异性探针。首先，提取P. alpinum 和P. bertolonii的总DNA，用Sau3AI部分酶切，然后将消化后片段用pUC19作为载体克隆到E. coli DH5amcr.构建了P. alpinum和P. bertolonii的部分基因组DNA文库（P. alpinum含3030 个colonies，P. bertolonii含3240 个colonies），接着从P. alpinum DNA文库中选了1230个克隆，从P. bertolonii DNA文库中选了1320个克隆斑点印迹在膜上，最后和通过缺口平移法采用［α～32P］-dCTP 标记的P. alpinum和P. bertolonii总基因组探针杂交，根据杂交信号挑选到P. alpinum特异性克隆8个，P. bertolonii特异性克隆13个，对其进行测序后筛选到3个P. alpinum特异性探针和3个P. bertolonii特异性探针。还有其它通过类似方法筛选到植物种特异性探针的例子［16,17］。 这种方法可以一次筛选大量克隆，能得到相当数量的探针，主要问题是构建DNA库过程比较繁琐，耗时费力，文库质量也会影响筛选效果。再是如果从cDNA文库中筛选，因cDNA是切除了内含子的DNA序列，而很多内含子本身在种间具有高度多态性（如rDNA中IST序列），这些序列的切除会降低种特异性探针的筛选效率。 　　3 从nrDNA筛选 因结构和功能上的差异，植物基因组不同部位