乌头简单序列重复区间扩增条件的优化.docVIP

　　乌头简单序列重复区间扩增条件的优化 作者：张岳峰 万里翔 侯大斌 【摘要】 　　目的保证乌头ISSR-PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性,亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR-PCR体系。结果以Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.3 μmol/L、rTaq酶1U、模板1.5 ng/μl、甲酰胺2%及退火温度（Tm-3）℃的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR-PCR体系反应稳定，能用于乌头的ISSR分析。 【关键词】 乌头 简单序列重复区间 优化 　　Abstract：ObjectiveTo keep the stability of ISSR_PCR and reliability of geic diversity, sibship analysis and source assessing for Aconitum carmichael Dexb. Methods23 kinds Aconitum carmichael Dexb. samples in souther and Taq polymerase) and 3 levels(concentration) orthogonal design experiment. Meanents for forma-mide, template concentration and annealing temperature affect could be ent by 23 samples ISSR-PCR reaction assessing.ConclusionThe optimized ISSR-PCR reaction system can be stably used for Aconitum carmichael Dexb. geic analysis. 　　Key carmichael Dexb.; Inter-Simple Sequence Repeat; Optimization 　　乌头Aconitum carmichael Dexb．为毛茛科乌头属植物，别名五毒根［1］。为毛茛科植物乌头，在 中国 西南地区四川盆地有较大栽培面积，其母根叫乌头或川乌，为镇痉剂，可用于治风痹、风湿神经痛。侧根（子根）入药，称附子(Radix Aconiti Lateralis Preparata)。 　　ISSR-PCR技术，简单序列重复区间(Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)，是Zietkie）已建立的附子资源圃200份附子种质资源类型中筛选出优势代表材料23份（见表1），上年种植，200707采摘顶部功能嫩叶数片，置4℃保存，提取DNA所用。 　　表1 乌头样品引种来源（略） 　　 2 方法 　　2.1 DNA提取采用陈亮［6］并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通过紫外和琼脂糖电泳检测其纯度、浓度和完整性后，用以ISSR-PCR优化实验。 　　2.2 反应体系正交实验 采用L9(34)正交实验设计，对Mg2+（大连TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）进行4因素3水平［7］筛选，方案如表2。根据表2制备总体积为20 μl的反应体系，体系中还存在1×PCR缓冲液和30 ng模板DNA，其余用过柱超纯水补充，引物选用哥伦比亚UBC系列847号引物，在德国Eppendorf Mastercycler Gradient仪上扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，Tm847－3℃(52.8-3=49.8℃)退火45 s，72℃延伸2 min，40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。 　　扩增结束后，PCR产物在1.5%的含溴化乙锭(0.5 μg/ml)琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为0.5×TBE,电压3V/cm,电泳结束在Bio-Rad凝胶成像系统分析并拍照。 　　2.3 模板DNA浓度筛选 应用表2中最佳组合，选用引物UBC846，20 μl体系中模板浓度分别置为0.5，1.5，3.0 ng/μl和6 ng/μl共4个浓度处理。 　　2.4 甲酰胺对扩增稳定性实验选定的正交最佳反应体系,选用引物UBC846，20 μl体系中设空白对照；甲酰胺(绵阳荣盛AR)浓度分别为0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。 　　表2 ISSR-PCR正交实验设计（略） 　　2.5 不同复性温度影响 根据正交最佳体系，结合引物UBC846用梯度P