乏氧-辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响.docVIP

　　乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响 作者：杨艳明 王志成 王铁君 王溪 曲雅勤 【摘要】 目的 构建乏氧（HRE）/辐射（Egr1）双敏感启动子介导的分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1HREEgr1shTRAIL，观察其对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响。方法 利用化学合成HRE上、下链，PCR扩增得到双链HRE；利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1HREEgr1shTRAIL，经酶切、PCR和测序鉴定正确后，干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞，MTT法检测A549细胞增殖的变化，流式细胞术检测A549细胞周期的变化。结果 BamH I和Sma I酶切，所得片段大小分别为1 284 bp和4 998 bp、2 292 bp和3 990 bp；以载体为模板，Egr1和shTRAIL引物进行PCR扩增，可得到469 bp和820 bp产物；将pcDNA3.1HREEgr1shTRAIL进行测序，所得结果与设计一致，说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后，乏氧与辐射能够降低细胞增殖能力，增加G0/G1和S期细胞百分比，降低G2/M期细胞百分比（P＜0.05，P＜0.01），二者联合作用更明显。结论 乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因在乏氧和/或辐射条件下能够延长细胞G0/G1和S期，缩短G2/M期，并且抑制肺腺癌A549细胞增殖能力，二者协同作用更明显。 【关键词】 乏氧/辐射；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)；增殖；周期 利用放射线诱导目的基因表达是近年来肿瘤 治疗 的一个新策略，即基因放射治疗〔1〕。而研究较多的辐射敏感启动子是早期生长反应1 (early groents，HRE) 包含核心基序5′ (A/G)CGT(G/C)(G/C)3′的顺式作用序列,在乏氧条件下HREs可显著增强下游基因的表达水平〔5〕。肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体(related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，可以大量、快速地杀伤肿瘤细胞，而人体的正常细胞对TRAIL诱导其凋亡耐受〔6〕。本研究利用HRE的乏氧应答性和Egr1放射诱导性，构建包含HRE/Egr1双敏感启动子介导的TRAIL基因表达载体，观察其在乏氧和/或辐射条件下对肺腺癌A549细胞增殖和细胞周期的影响，为揭示肿瘤基因放射治疗新策略提供必要的实验基础。 1 材料与方法 1.1 pcDNA3.1HREEgr1shTRAIL载体的构建及鉴定 pcDNA3.1CMVEgr1shTRAIL载体已构建完成。pcDNA3.1CMVEgr1shTRAIL用Mlu Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切，回收载体片段；HRE上、下链采用化学合成获得（上海生工），两端加入Mlu Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点，PCR合成双链，反应条件为：94 ℃变性3 min、50℃退火45 s和72 ℃延伸10 min，30个循环，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收产物，然后用Mlu Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切，电泳后再回收酶切后的HRE片段；将载体与HRE片段用T4 DNA连接酶连接。PCR扩增鉴定，引物序列，Egr1，F1：5′GGGGTACCGACCCGGAAACGCCATATAAG3′，加入KpnⅠ酶切位点，R1：5′ATAAGAATGCGGCCGCCCAAGTTCTGCGCGCTGGG3′，加入Not Ⅰ酶切位点，扩增产物长度469 bp；shTRAIL，F2：5′CTAGTCTAGACACCATGAGCACTGAAAGCATGATC3′，加入XbaⅠ酶切位点，R2：5′CGGGATCCCTAGTTAGCCAACTAAAAA3′，加入BamH Ⅰ酶切位点，扩增片段大小为820 bp；酶切鉴定，采用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切；测序鉴定，由上海生工完成测序。所用限制性内切酶、T4 DNA连接酶和DL2000 Marker、质粒小提试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自天为时代公司。 1.2 细胞培养及实验分组 肺腺癌A549细胞株由吉林大学卫生部放射生物学重点实验室保存，人肺腺癌A549细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM（Gibco公司）中，置于37℃、5% CO2的培养箱中，2～3 d传一代，细胞同步化生长后表达载体与Lipofectamine TM 2000（Invitrogen公司）按照说明书（质粒∶脂质体=1∶2.5）转染。实验分为正常组、乏氧组（1%）、辐射组(6 Gy)和乏氧+辐射组。 1.3 载体