人乳腺癌组织支原体感染的检测.docVIP

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人乳腺癌组织支原体感染的检测.doc

  人乳腺癌组织支原体感染的检测 作者:叶明 李鹏 王远明 顾宏牵 【摘要】 目的 探讨支原体感染和乳腺癌发生、预后的关系及可能的影响机制。方法 应用免疫组化方法及逆转录多聚酶链反应,对165例乳腺癌组织及癌周正常乳腺组织、80例乳腺良性病变组织支原体感染及 c-myc、H-ras基因表达进行检测。结果 乳腺癌组织、乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织猪鼻支原体PD4阳性率分别是30.30%、9.70%、7.50%,前者与后两者之间比较,差异均有统计学意义(χ2分别=21.89、15.89,P均lt;0.05)。支原体感染阳性、阴性的乳腺癌组织c-myc 、H-ras 基因表达率分别是50.00%、27.83%,两者之间差异有统计学意义(χ2=7.57, Plt;0.05);支原体感染阳性、阴性的乳腺癌患者5年生存率分别是80.01%、87.02%,两者之间比较差异无统计学意义(χ2=1.31,Pgt;0.05)。结论 乳腺癌组织支原体感染率较高,支原体感染的乳腺癌组织c-myc、H-ras 基因表达率增高,可能和乳腺癌的发生存在一定的相关性,但和预后没有相关性。 【关键词】 乳腺癌 支原体 基因 支原体是广泛存在于 自然 界的条件致病微生物,并可与哺乳动物长期相互作用的原核生物。有学者报道,穿透支原体能使极少发生转化的小鼠胚胎细胞系C3H10T1/2恶变,且在软琼脂上形成集落,在裸鼠体内成瘤[1],引起了许多学者的关注。细胞癌基因c-myc、H-ras在乳腺癌组织中呈高表达,可能和乳腺癌的发生、 发展 存在一定的相关性[2]。本次研究对乳腺癌组织进行支原体、c-myc、H-ras基因进行检测,探讨支原体感染和乳腺癌发生、预后的关系及可能的影响机制。 1 资料与方法 1.1 组织标本 取2001年1月至2007年7月三门县人民 医院 165例乳腺癌组织及石蜡标本,所有乳腺癌患者均为女性,平均年龄(48.25±12.78)岁。其中浸润性癌23例、中高分化腺癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌142例,根据国际抗癌协会分期法(tumor node metastasis,TNM) [3]:Ⅰ期28例,Ⅱ期85例,Ⅲ期52例。所有患者术前未行放疗或化疗,随访时间5年,随访率100%。80例女性乳腺良性病变患者作为对照组,平均年龄(50.67+9.45)岁,其中乳腺纤维瘤55例、乳腺囊性增生症25例。两者一般情况差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 1.2试剂、步骤、方法 单克隆抗体PD4(由北京大学临床肿瘤医院寿成超教授馈赠),其对应抗原为猪鼻支原体的一种膜蛋白,EnVisionTM+试剂盒(购自DAKO公司)。TRizol Reagent、引物、反转录酶、多聚酶链反应扩增试剂盒(由上海生工有限公司生产)。采用EnVision二步法进行检测, 磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照,用已知阳性乳腺癌组织切片作阳性对照,具体步骤按照试剂盒说明书进行操作,过程为4 um切片,脱蜡,酒精水化,3%过氧化氢10 min,微波炉内进行抗原修复,加单克隆抗体,4℃过夜,经磷酸盐缓冲液洗涤后加入二抗及相应的底物显色液,封片后进行观察。 1.3 引物、反应条件、扩增条带  TRizol 一步法提取总RNA,以提取液作为模板采用cDNA逆转录,后按照聚酶链反应扩增试剂盒说明指南进行操作。内参照基因GAPDH:扩增长度;672bp,上游引物:5′-TCA CCA TCT TTC AGG AGC GAG-3′,下游引物:5′-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3′,c-myc(扩增长度216bp)上游引物:5′-GAATGTCAAGAGGC-GAACACA-3′,下游引物5′-CGTCGTTTCCGCA-ACAAG-3′,PCR扩增条件:93℃温育5min; 94℃ 变性30s, 64℃复性30s, 72℃ 延伸1min,共36个循环。末次循环 72℃延伸5min。H-ras(扩增长度170bp),上游引物:5′-AGGGCCCTCCTTGGCAGG-3′,下游引物:5′-GTCGTATTCGTCCACAAAATGC-3′,95℃温育5min; 94℃ 变性30s, 58℃复性30s, 72℃ 延伸1min,共36循环。末次循环 72℃延伸5min。后取扩增产物进行电泳。表达阳性者可见目的基因和内参基因两条条带,表达阴性者仅见内参基因一条条带。3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的扩增条带为672bp,c-myc的扩增条带为216bp, H-ras的扩增条带为170bp。 1.4 判断标准 随机选择5个高倍视野,按照阳性细胞占肿瘤细胞百分比的平均数划分,阴性:阳性≤25%且染色浅;阳性:阳性细胞gt;25%且染色

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