实验7CHO细胞药物处理离心后中间纤维免疫酶标染色201310.pptxVIP

上海交大生命学院 2012年9月;1、明确细胞免疫化学技术的相关知识 2、掌握间接免疫酶标法的原理和操作 3、了解细胞骨架蛋白质的相关知识 4、学会设计实验对照组 ;;免疫（Immunity）：指生物体识别和排除抗原异物，以维护自身生理平衡和稳定的功能。 免疫功能：免疫防御（病源微生物）；免疫稳定（衰老死亡细胞）；免疫监视（肿瘤细胞） 免疫系统：包括免疫器官（中枢——骨髓和胸腺，外围——脾、淋巴结、淋巴组织）、免疫细胞和免疫分子（包括抗体、补体和细胞因子 ）。;抗体（antibody，Ab）：当动物机体受到抗原物质刺激后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的能与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。 免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）：指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。 Ig基本结构：所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L），每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。 ; 抗原的一般概念：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质。 抗原物质必须具备的条件： 一、异物性：指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。 二、一定的理化性状：凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大结构越复杂免疫原性越强。 三、完整性：须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白 四、宿主的遗传性：抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制， ;抗原决定簇（Antigenic determinant）;抗原与抗体特异性结合，形成抗原抗体复合物。 抗原抗体反应的一般规律： 1 特异性、交叉反应性 2 可逆性：表面的结合，有可逆性 3 适比性：比例合适，反应才可见。 4 阶段性：不可见-------可见反应 5 条件依赖性：pH，温度，电解质 ;;采用传统的免疫方法，将抗原物质经过不同途径注入动物体内，经数次免疫后采血所获得的抗血清即为多克隆抗体。 ;单克隆抗体monoclonal antibody，mAb;;;一抗和二抗;常用免疫学技术;发展历史;免疫细胞化学（Immunocytochemistry）定义： 也称免疫组织化学，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。 对抗原和抗体的要求 　　——对抗体的要求：特异性高、亲和力强、纯度高、活性高。 　　——对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 ;抗原的提取与纯化； 制备特异性抗体以及抗体的纯化； 标记抗体； 标本的制备； 免疫细胞化学染色； 观察结果。;标记物特点： 1）与抗体形成牢固共价键 2）不影响抗原与抗体的结合 3）放大的效率高 4）原位显示;;在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其存在的部位。;常用荧光素;常用技术方法;荧光抗体染色结果判断;显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原 抗原抗体反应特异性 ＋ 酶催化反应的高度敏感性 ;;常用的酶及其底物;免疫荧光与免疫酶标比较;用酶标抗体与组织或细胞抗原结合，显色后在电镜下观察。免疫反应特异性与电镜高分辨力结合。 可观察亚细胞水平和超微结构，高精确度、高灵敏度。 示踪物：电子致密物质。 Singer (1959)首创此项技术，使用铁蛋白标记。目前主要有过氧化物酶和胶体金标记。 过氧化物酶分解DAB的产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，经过Os04处理后变黑，具有高电子密度，适合于电镜观察。酶标抗体分子量较铁蛋白小，较易透过处理后的组织细胞膜，能定位胞内抗原。但酶反应产物的分辨率不如颗粒性标记物高(如铁蛋白，胶体金)。 ;狭义指真核细胞中由微管、微丝和中间纤维构成的相互作用的网络。 广义的细胞骨架包括核骨架、膜骨架、细胞质骨架和细胞外基质，形成贯穿于细胞核、细胞质、细胞外的一体化网络结构。 ;7nm Microfilament MF;作为生命基本单位的细胞其各种生理活动，如细胞形态的改变和维持、细胞内物质运输、内吞和外排、免疫行为、能量转换和细胞分裂等无不伴随着各种运动。这些运动中表现出的组织性、方向性等都与细胞骨架相关。 特点：1. 弥散性 2. 整体性 3. 变动性;2013/11/11;;;抗体稀释度;对照设置;;原因分析;中华仓鼠卵巢细胞（Chinese h