促性腺激素释放激素对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响.docVIP

　　促性腺激素释放激素对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响 作者：曹宏伟, 蒲若蕾, 黄威权, 姚兵, 陈蕾, 张荣庆, 姬秋和 【摘要】 目的： 通过观察GnRH类似物（GnRHR激动剂和拮抗剂）对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的 影响 ，了解cAMP在GnRHR介导的信号转导通路中的作用. 方法 ： 以不同浓度GnRH类似物对原代培养的大鼠胰腺细胞进行刺激，借助放免法测定观察在体外条件下GnRH类似物对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响. 结果： 在量效实验中，各浓度GnRHR激动剂均能使细胞内cAMP含量增加，其中10-8～10-5mol/L中4个浓度组最为明显，与对照组相比有非常显著差异（Plt;0.01）. 应用 GnRHR拮抗剂（10-6mol/L）后明显抑制了激动剂组增高cAMP含量的作用，其cAMP水平与对照组比较没有显著差异（Pgt;0.05）. 在时效实验中，应用10-7mol/L GnRHR激动剂刺激细胞，从10 min起细胞内cAMP含量即开始增多，到1 h达到峰值，以后逐渐下降，8 h后恢复到原水平. 结论： 由以上结果推测cAMP可能是GnRHR 介导的信号转导通路中的信号分子之一. 【关键词】 大鼠；胰腺；促性腺激素释放激素受体；信号转导；环磷酸腺苷 　　【Abstract】 AIM: To observe the effects of stimulators and blockers of gonadotropin releasing hormone (GnRH) receptors on cAMP production by rat pancreatic cells in vitro. METHODS: Cell culture and radioimmunoassay edia supplemented ulate cAMP production in a concentrationdependent manner from 10-8 to 10-5 mol/L, ol/L，Plt;0.01).The cAMP production could be stimulated by the GnRH agonist(10-6 mol/L) in a timedependent manner, ulation and returned to its original level at 8 h later. CONCLUSION： cAMP may be one of the signaling factors involved in the GnRH receptors signaling pathone receptor(GnRHR）；signaling patha公司）；cAMP放免检测试剂盒（北京 中国 原子能研究院同位素研究所）；当日生同窝SD大鼠（北京维科利华实验动物中心）. 　　1.2 方法 　　1.2.1 大鼠胰腺腺泡细胞的原代培养 将等体积胰酶与胶原酶混合成细胞分离液，预热至37℃待用. 乳鼠行颈椎脱臼法处死，75 mL/L酒精溶液中消毒3～5 min，移入超净台，剖腹，无菌条件下取胰腺组织，放入4℃ Hanks液中；小心去除被膜及脂肪组织，用弯头眼科剪将其剪成1 mm3左右的碎块；将5 mL预热的细胞分离液移入25 mL锥形瓶中，37℃下消化15 min（其间摇动数次）；待大块组织沉降后，40 μm 筛网过滤. 用新鲜的细胞分离液重复以上步骤2次，收集滤液，离心后重新悬浮于10 mL Hanks液中. 在另外两个离心管中加入35 mL BSA，每管溶液上轻轻移入5 mL 细胞悬液，100 g离心5 min，弃上清. 重复以上步骤两次. 悬浮细胞于1640培养液中，接种于25 cm2 培养瓶，放入体积分数50 mL/L CO2，37℃ 培养箱内培养30 min，把培养液倒入另一培养瓶，其中即为较纯的上皮样细胞；隔日换液，利用时差贴壁法进行纯化，直至成纤维样细胞被去除. 　　1.2.2 细胞分组施加刺激因素 纯化的胰腺腺泡细胞生长状态稳定后，消化分离记数细胞，接种于24孔板；待细胞生长满至孔底时（24 h），更换含20 mL/L 血清的培养液使细胞同步化；不同药物浓度（剂量效应）刺激：分别给予各孔内加入10-9，10-8，10-7，10-6 ，10-5 GnRH agonist，10-7 GnRH agonist +10-6 GnRH antagonist，孔内不加药物作为对照组；不同药物作用时间（时间效应）刺激（药物浓度：10-7 GnRH agonist）：分别给予 0，5，10，30，60 min，2，4，8，24 h作用时间. 　　1.2.3 检测样品制备 分别按