化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验素材.doc

化合物对三种肿瘤细胞干预下的细胞毒性实验 一、材料与方法 实验材料 1.1实验材料 Hela细胞（宫颈癌细胞）、Eca-706细胞(食管癌细胞)、PC-12细胞（神经胶质瘤细胞）、53种化合物 1.2主要仪器 CO2恒温培养箱：力申HF151 生物安全柜：阿尔泰实验室设备（北京）有限公司BHC-1300ⅡA2 低速大容量离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司LC-4016 相差倒置显微镜：宁波舜宇仪器有限公司XD30Axio Observer A1 恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂H21-4 液氮罐：成都金凤液氮容器有限公司YDS-65-216 分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司BSA224S-CW 全光栅酶标仪：美国莫赛飞世尔Mμltiskan GO 调速多用振荡器：金坛市华峰仪器有限公司HY-4 1.3主要试剂 表1 名称 厂家 货号/批号 PBS磷酸盐缓冲液粉剂 北京中杉金桥 ZLI-9062 胎牛血清 美国Hyclone 16000-004,Lot#GM K0070 DMEM培养基（高糖） 美国gibco 12800-017 ,Lot#1655697 0.25%胰酶 美国gibco 25200-056, Lot#1627654 青霉素-链霉素双抗 美国gibco 15140-122 ,Lot#1631430 MTT（噻唑蓝） 美国sigma M-2128 DMSO（二甲基亚砜） 美国sigma 67-68-5，Lot#67-68-5 CCK-8 上海贝博 BB-4202-2，BB150011 实验方法 2.1试剂配制、抗体稀释及53种化合物的溶解 DMEM培养基：DMEM培养基粉末溶于1L经0.22μm孔径滤膜过滤后的超纯水中，用NaHCO3调PH值至7.2-7.6之间。 10%血清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。 MTT溶液：称取150mgMTT，溶于30ml未过滤的PBS中，用0.22 μm的滤膜过滤后待用。 53种化合物的浓溶液：10mg化合物加入200μl DMSO溶解，再加9.80 ml完全培养基配成终浓度为1mg/ml的化合物浓溶液（有些化合物200μl DMSO不能溶解，具体DMSO用量见结果与分析）。 冻存液：6ml无血清培养基中加入3ml胎牛血清和1ml DMSO（培养基：血清：DMSO=6:3:1）。 2.2 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞培养基本操作方法 2.2.1细胞复苏 1、从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37℃水浴锅中快速晃动冻存管使细胞快速解冻； 2、将细胞转移至15ml离心管中，1000rpm，6min离心后，弃培养基； 3、用DMEM完全培养基 1ml重悬细胞，并接种到25ml培养瓶中； 4、显微镜下观察细胞密度合适并且无细胞聚团后，置于37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。 2.2.2细胞传代 1、观察培养瓶中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代 2、开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备细胞培养瓶、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、DMEM完全培养基， 3、取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的DMEM完全培养基终止胰酶的消化作用，并用1ml移液器反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800rpm离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中于37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养。 2.2.3细胞冻存 1、消化、离心步骤同细胞传代； 2、离心后弃去培养基，加入1ml的细胞冻存液重悬混匀后移至2ml的冻存管中； 3、冻存管中细胞经4℃（30min）、-20℃（30min）、-80℃（过夜）的程序降温后，转移至液氮中冻存。 2.3 MTT法对53种化合物的筛查实验 2.3.1 Hela细胞、Eca-706细胞、PC-12细胞的接种 1、消化、离心、重悬的步骤同细胞传代； 2、取50μl细胞悬液用于细胞计数板进行计数，计数后调整细胞浓度至1 ×105个/ml待用； 3、将细胞接种到96孔板中，接种Hela和PC-12细胞时每孔加50 μl细胞悬液（5000个细胞/孔），接种Eca-706时每孔加100 μl细胞悬液（10000个细胞/孔），每孔用完全