家兔血清r-球蛋白分离与纯度鉴定1.ppt

家兔血清??球蛋白分离与纯度鉴定  （一） 一、目的与要求 1. 了解层析原理 2. 掌握凝胶层析技术  1、层析(又名色谱):是利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。 2、按层析原理分类: 分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力 二、实验原理 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 吸附层析 ■ 3.按操作方式不同分类: 圆形滤纸 长条滤纸 薄层层析 (TLC) 柱层析 容量变大 容量更大 加展开液 4、层析的发展 1903年---俄国植物学家:茨维特发表了有关 填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石 油醚冲洗，得到黄色、绿色区带; 1970年早期:高效液相色谱法（HPLC) 目前:气相层析仪和HPLC与色谱、质谱 以及计算机联用。 层析法进行时有两个相: 一个相称为固定相，另一相称为流动相 支持物 (固体，液体） 含待分离物质 （液体，气体） ↓ 但液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体（support) 层析中的常用术语 一、保留值(Retention Value) 二、层析峰区域宽度(Peak Width) 图3-1 A、B两组分的保留值 A保留值tR1’=tR1-tm B保留值tR2’=tR2-tm 三、分离度(Rs) 四、分配系数 五、柱效 ■ 凝胶层析法：指混合物随流动相经固定相的层析柱时， 混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。 样品 固 定 相 流 动 相 小分子 被延滯 小分子 大分子 较快流出 分子筛效应： 分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。 注：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细无关 next 固定相（凝胶） ——三维空间网状结构 A good gel for gel filtration contains about 95% water 目前应用最多的为葡聚糖凝胶(Sephadex)，它是一种以环氧氯丙烷作交联剂交联聚合而成的右旋糖苷珠形聚合物。聚合物具有主体多糖网状结构，其网孔大小与交联度有关，交联度越大，网状结构越致密，网孔的孔径越小；交联度越小，网状结构越疏松，网孔的孔径越大。在Sephadex后面缀上G-X作为交联度的标记。交联度越小，吸水量越大，X值越大。 ? 凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定; 2.操作条件较温和; 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。 凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低; 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制; 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。 三、操作步骤 (一）盐析 免疫家兔血清,正常家兔血清,人正常血清各2.0ml ↓ 分别加入小试管中，加PBS液2.0ml摇匀 ↓ 逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2.0ml，边加边摇匀 ↓ 静置15min，3000rpm离心10min，倾去上清液 ↓ 沉淀用1.0mlPBS液溶解，饱和硫酸铵液0.5ml，混匀 ↓ 静置15min，3000rpm离心10min，倾去上清液,沉淀用PBS液10滴搅拌溶解，即为初步纯化的??球蛋白溶液。 (二) 脱盐和??球蛋白的分离 1. 装柱：取1.5?15cm 层析柱1 支（若底部无烧结板，用一小块海绵或棉花堵住下端）装入约1/3柱高的蒸馏水，排除底部死腔气泡，至剩余约2～3cm柱高的水时关闭出口。沿柱内壁缓慢灌入稀糊状葡聚糖凝胶G?25悬液至2/3柱高，严防气泡及断层。待分层后打开出口，当水全部进入床面以后，沿柱内壁缓慢加入PBS液共约4ml，平整床面，待液面