DIG标记+原位杂交 实验流程-化-2015.5.11.pdfVIP

地高辛标记的 CRNA 探针合成实验流程 1. CDNA 文库的构建 2. PCR 扩增目的基因 3. 二次PCR 扩增带T7 启动子的目的基因 4. 体外转录合成地高辛标记CRNA 探针 1. CDNA 文库的构建 1. MRNA 的分离纯化 （使用无RNase 物品） i. 取两个1ml 玻璃匀浆器，分别加入1ml RNAiso Plus （通风橱操作）。快速取 出鼠脑，冰上操作。新鲜的脑组织一半，分别加入两个1ml 玻璃匀浆器中， 分别加入，放入玻璃匀浆器，冰浴匀浆。 ii. 将匀浆液转移至离心管中，室温（15-30℃）静置 5 分钟。 iii. 12,000 g 4℃离心 5 分钟。 iv. 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 v. EP 管中加入氯仿200ul （RNAiso Plus 的 1/5 体积量），盖紧离心管盖，剧 裂震荡，混合至溶液乳化呈乳白色。 vi. 室温静置 5 分钟。 vii. 12,000 g 4℃离心 15 分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为 三层，即：无色的上清液（含 RNA ）、中间的白色蛋白层（大部分为 DNA） 及带有颜色的下层有机相。 viii. 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）。 ix. 向上清中加入 0.5-1 倍 RNAiso Plus 体积的异丙醇500ul，上下颠倒，轻柔 操作，离心管充分混匀后， 室温下静置 10 分钟。 x. 4℃ 12,000 g 离心 10 分钟。一般在离心后，试管底部会出现 RNA 沉淀。 小心弃去上清, 切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。 xi. 加入与 RNAiso Plus 等量的 75 ％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁; xii. 7,500 ×g ，4℃，离心 5 分钟，小心弃去上清，切勿触及沉淀。 xiii. 通风橱中干燥3—5min ；切不可加热干燥； xiv. 加入20—30ul 的DEPC 处理的ddH20，静置2min，吹打均匀，每管分装5ul， -80 度冰箱保存。 总RNA 的鉴定： 一、 1%的琼脂糖凝胶电泳 二、 紫外分光光度计，测在260nm/280nm，计算RNA 的浓度和纯度 OD260/280 在1，72.0 之间即可。 浓度一般应在200ng/ul 以上。 2. RT-PCR 逆转录为 CDNA 1）在 PCR 管中进行，PCR 仪设定程序 a. Oliga （dT）15 1ul （TAKARA ，code3805 ；LOT T801BA ） b. RNA （1ng—5ng）根据提取的RNA 的浓度来计算加入量 c. 10nM DNTP Mix 1ul （天根） d. DEPC H2O 补足12ul 65℃ 5min 后，立即冰浴，轻甩。 2）依次加入 a. 5x first-strand buffer 4ul （invitrogen，lot NO 991492） b. 0.1M DTT 3ul （invitrogen，1305658 ） c. RNsin （RNase